Utilização do extrato enriquecido em isoflavonas do trevo-vermelho (Trifolium pratense L.) como nova estratégia terapêutica para artrite reumatoide

Abstract

Introdução: O trevo-vermelho (Trifolium pratense L.) é uma importante leguminosa que contém as isoflavonas genisteína, dadizeína, formononetina e biochanina A em maiores concentrações. Diversos benefícios à saúde humana já foram demonstrados pelo uso destas isoflavonas isoladamente ou pelo extrato do trevovermelho em aspectos como terapia de reposição hormonal, terapia anticâncer, agente antioxidante e regulador do metabolismo. Alguns trabalhos também apontam o papel destes compostos como anti-inflamatórios. Entretanto seu uso como antiinflamatório administrado via oral em modelos animais de inflamação ainda não foi demonstrado. Ainda, sabe-se que as isoflavonas bioativas encontradas no trevovermelho são altamente polares, dificultando assim sua absorção. Por isso, modificações na apresentação farmacêutica dessas moléculas como complexação a ciclodextrinas, incorporações em óleos ou emulsões pode auxiliar na absorção. E por fim, essa melhora na farmacocinética da droga pode aumentar a sua eficácia. Objetivos: Nosso objetivo neste trabalho foi explorar o uso do extrato enriquecido do trevo vermelho complexado com ciclodextrinas como terapia anti-inflamatória em um modelo animal de artrite e em modelo inflamatório e imunomodulador in vivo e in vitro.Métodos: A preparação do extrato seco de trevo-vermelho utilizado neste estudo é resultado de um trabalho prévio realizado pelo laboratório de Farmacognosia da Faculdade de Farmácia (UFRGS). O modelo in vivo de inflamação utilizado foi o modelo de monoartrite foi induzido por proteína bovina metilada (mBSA). administrações semanais do antígeno foram feitas subcutâneamente por três semanas com adjuvante e por fim o desafio intra-articular foi feito com a proteína. Os animais foram tratados dois dias antes do desafio intraarticular com o extrato total do trevo-vermelho complexado ou não a ciclodextrinas a cada 12h. A avaliação da inflamação deste modelo foi feita pela migração de neutrófilos para a articulação 24h após o desafio intra-articular e a nocicepção (representando a percepção de dor) medida entre o período do desafio intra-articular e a morte dos animais nos tempo (0h – desafio, 1h, 3h, 6h e 24h). Ainda, in vitro o modelo utilizado foi proliferação de linfócitos. Nesses experimentos, o extrato foi administrado tanto com um tratamento direto sobre os linfócitos em cultura (experimentos in vitro) quanto com linfócitos retirados dos animais tratados com o extrato via oral (experimentos ex vivo). Por fim, ensaios de citotoxicidade foram realizados para verificar a viabilidade celular do extrato sobre linfócitos. Resultados: O extrato do trevo-vermelho demonstrou efeito anti-inflamatório quando administrado via oral em modelo animal de artrite (in vivo) Isso foi demonstrado por redução de migração de células inflamatórias pela redução da dor Ou em modelo inflamatório de cultura de células (in vitro e ex vivo). Demonstrado pela redução da proliferação de linfócitos Complementarmente comprovamos por ensaios de citotoxicidade que o extrato utilizado não apresenta danos às células. Por fim, utilizando processos de tecnologia farmacêutica, demonstramos que a quando complexado a cliclodextrina o extrato do trevo vermelho apresenta maior eficácia. Conclusão: O extrato total do trevo-vermelho demonstrou ser uma possível alternativa terapêutica para o tratamento de doenças inflamatórias. Ainda, a complexação com ciclodextrina demonstrou maior eficácia do extrato. Esse achado foi capaz de gerar uma patente sobre o uso deste extrato do trevo-vermelho complexado com ciclodextrinas em processos inflamatórios.

Background: Red clover (Trifolium pratense L.) is an important herbaceous which contains isoflavones genistein, daidzein, formononetin and biochanin A in higher concentration. Those isoflavones isolated or together as a role extract have been demonstrated to have a variety of beneficial effects to human health such as hormone therapy replacement, anti-cancer therapy, anti-oxidative therapy or metabolism regulator. Some authors also demonstrated those compounds as antiinflammatory agents; however their use as oral anti-inflammatory agent in animal model has not yet been related. Yet, bioactive isoflavones found in red clover are extremely polar and by so hardly absorbed. For this reason, pharmaceutical changes in this molecules such as cyclodextrins complexions may improve absorption. Finally this pharmacokinetic improvement may incrasse drug efficiency. Objective: Our aim whit this study was to explore the use of enriched extract of red clover complexed with cyclodextrins as anti-inflammatory and immunomodulatory therapy in an animal model of arthritis and in and in experimental inflammatory model in vitro. Methods: The preparation of dry extract of clover used in this study is the result of a previous study carried out by the laboratory of Pharmacognosy, Faculty of Pharmacy (UFRGS). In vivo model of inflammation used was monoarthritis was induced by methylated bovine protein (mBSA) Shortly, weekly administrations of antigen were made for three weeks subcutaneously with adjuvant and finally intra-articular challenge was done with the protein. The animals were treated two days before the challenge intra-articular with total extract of red clover complexed or not to cyclodextrins every 12 hours. The evaluation of this model of inflammation was made by the migration of neutrophils to the joint 24 hours after intra-articular challenge and nociception (representing the perception of pain), measured from the time of challenge intra-articular to the death of the animals in time (0h - challenge, 1h, 3h, 6h and 24h - death). In addition, in vitro experiments on lymphocyte proliferation were both made from this extract with a direct treatment of the lymphocytes in culture (in vitro experiments) or with lymphocytes taken from animals treated orally with the extract (ex vivo experiments). Finally, cytotoxicity tests were conducted to measure the viability of the cell extract on lymphocytes Results: The red clover extract has shown anti-inflammatory effect when administered orally to an animal model of arthritis or inflammation in a model cell culture. This was demonstrated by reducing inflammatory neutrophil migration and by reduction of pain. Additionally all concentrations used did not demonstrated cytotoxicity. Finally, using pharmaceutical technology processes, we demonstrated that when complexes with cyclodextrin the extract shows the same effects at lower doses, this attributed to a better solubility of the drug. Conclusion: Red clover total extract has proved to have to be a potential therapeutic approach for the treatment of inflammatory diseases. Further, complexion with cyclodextrin showed the same efficacy of the extract even at lower doses. This finding has been able to generate a patent on the use of this red clover extract complexes with cyclodextrins in inflammatory processes.