Influência da disbiose intestinal no risco cardiovascular em modelo experimental híbrido de doença hepática gordurosa não-alcoólica em ratos

Abstract

Introdução: A doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA) é uma doença hepática progressiva que é considerada um fator de risco para o desenvolvimento de doença cardiovascular (DCV). Transtornos do eixo fígado-intestino, incluindo a disbiose intestinal, têm sido associados à DHGNA e DCV. Objetivos: Desenvolver um modelo experimental de DHGNA de origem metabólica que permita avaliar, na sequência, fatores relacionados à DCV, como índices aterogênicos, inflamação hepática e sistêmica e disfunção endotelial, bem como a associação entre a composição e a diversidade da microbiota intestinal e sua relação com o risco de desenvolvimento de DVC. Métodos: Ratos Sprague Dawley, adultos e machos, foram randomizados em dois grupos (n=10): controle, alimentado com dieta padrão, e intervenção, que recebeu dieta hiperlipídica deficiente em colina. O experimento teve duração de 16 semanas e após os animais foram eutanasiados. Os materiais biológicos foram coletados e armazenados até a realização das avaliações bioquímicas, inflamatórias, histológicas e da microbiota fecal. Resultados: Os animais do grupo intervenção apresentaram significativo aumento no delta de índice de Lee (p = 0,017), circunferência abdominal (p < 0,001), acúmulo de tecido adiposo abdominal (p < 0,001), bem como elevação dos níveis séricos de alanina aminotransferase (p = 0,010), glicemia (p = 0,013), colesterol total (p = 0,033), lipoproteína de baixa densidade (p = 0,011) e triglicerídeos (p = 0,011) e diminuição dos níveis séricos de lipoproteína de alta densidade (p = 0,006), similares às observadas na DHGNA em humanos. Todos os animais do grupo intervenção desenvolveram DHGNA, com ou sem a presença de esteato-hepatite, enquanto no grupo controle não houve qualquer alteração histológica. Houve aumento significativo no grupo intervenção dos índices aterogênicos, coeficiente aterogênico (p < 0,001), índice de risco Castelli-I (p < 0,001) e índice de risco Castelli-II (p < 0,001), além de aumento significativo na concentração dos marcadores de inflamação e disfunção endotelial sistêmica, interleucina (IL)-1β (p < 0,001), proteína quimiotática de monócitos-1 (p < 0,001), inibidor tecidual de metaloproteinases-1 (p < 0,001) e inibidor do ativador de plasminogênio-1 (p < 0,019). Houve um aumento na expressão gênica hepática do receptor toll like (TLR)-4 (p = 0,041), TLR-9 (p = 0,033), fator de diferenciação mielóide-88 (p = 0,001), receptor do tipo NOD-proteína-3 (p = 0,019), capase-1 (p < 0,001), fator de necrose tumoral-α (p = 0,028), IL-6 (p = 0,013) e IL-18 (p = 0,007), além da diminuição das expressão do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma-α (p = 0,008) em relação ao grupo controle. Observamos aumento significativo de miR-122 (p = 0,041) e miR-33a (p = 0,001) no grupo intervenção, e o inverso foi observado para miR-145 (p = 0,010) e miR-126 (p < 0,001). O grupo intervenção, apresentou diminuição significativa da diversidade bacteriana fecal e menor abundância relativa do filo Firmicutes (p = 0,040), o que se correlacionou com a gravidade histológica da DHGNA. Conclusão: O grupo intervenção apresentou alterações bioquímicas, inflamatórias e histopatológicas similares àquelas observadas na DHGNA em humanos. Houve neste grupo, um aumento da obesidade visceral, dislipidemia, hiperglicemia, inflamação hepática e sistêmica, disfunção endotelial e um maior risco de desenvolvimento de DCV. Este modelo experimental, poderia ser utilizado no entendimento da fisiopatologia da DHGNA e sua evolução, bem como para estudos terapêuticos pré-clínicos que visem à cardioproteção na DHGNA, um desfecho habitualmente não avaliado em ensaios clínicos em humanos.

Introduction: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a progressive liver disease that is considered a risk factor for the development of cardiovascular disease (CVD). Liver-gut axis disorders, including intestinal dysbiosis, have been associated with NAFLD and CVD. Objective: To develop an experimental model of NAFLD of metabolic origin that would allow to evaluate, in the sequence, factors related to CVD, such as atherogenic indices, hepatic and systemic inflammation and endothelial dysfunction, as well as the association between the composition and diversity of the gut microbiota and its relationship with the risk of developing CVD. Methods: Adult male Sprague Dawley rats were randomized into two groups (n = 10): control group that was fed standard diet and intervention group that received a high-fat and choline-deficient (HFCD) diet. The experiment had duration of 16 weeks and after the animals were euthanized. Biological materials were collected and stored until the biochemical, inflammatory, histological and fecal microbiota evaluations were performed. Results: The animals in the intervention group, showed a significantly greater delta Lee index (p = 0.017), abdominal circumference (p < 0.001), abdominal adipose tissue accumulation (p < 0.001), as well as elevation of serum levels of alanine aminotransferase (p = 0.010), glycemic (p = 0.013), total cholesterol (p = 0.033), low-density lipoprotein (p = 0.011), triglycerides (p = 0.011) and decreased serum levels of high-density lipoprotein (p = 0.006), corresponding to those observed in NAFLD in humans. All animals in the intervention group developed NAFLD, with or without the presence of steatohepatitis, while no histological changes were found in the control group. There was a significant increase in the intervention group, of atherogenic indices, atherogenic coefficient (p < 0.001), Castelli-I risk index (p < 0.001) and Castelli-II risk index (p < 0.001), increased markers of systemic inflammation and endothelial dysfunction, interleukin (IL)-1β (p < 0.001), monocyte chemotactic protein-1 (p < 0.001), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (p < 0.001) and inhibitor of plasminogen activator-1 (p < 0.019). There was an increase in hepatic gene expression of toll-like receptor (TLR)-4 (p = 0.041), TLR-9 (p = 0.033), myeloid differentiation primary response-88 (p = 0.001), nod-like receptor protein-3 (p = 0.019) caspase-1 (p < 0.001), tumor necrosis factor-α (p = 0.028), IL-6 (p = 0.013) and IL-18 (p = 0.007), besides the diminution of the expression of peroxisome proliferator activated receptor-α (p = 0.008) in relation to the control group. We observed a significant increase of miR-122 (p = 0.041) and miR-33a (p = 0.001) in the intervention group, and the inverse was observed for miR-145 (p = 0.010) and miR-126 (p < 0.001). The intervention group showed a significant decrease in the fecal bacterial diversity and lower relative abundance of the Firmicutes phylum (p = 0.040), which correlated with the histological severity of NAFLD. Conclusion: The intervention group presented biochemical, inflammatory and histopathological alterations, similar to those observed in NAFLD in humans. There were in this group, an increase in visceral obesity, dyslipidemia, hyperglycemia, systemic and hepatic inflammation, endothelial dysfunction and an increased risk of developing CVD. This experimental model could be used to understand the pathophysiology of NAFLD and its evolution, as well as for preclinical therapeutic studies that aim at cardioprotection in NAFLD, an outcome not usually evaluated in clinical trials in humans.