Estratégias biotecnológicas para o reposicionamento de fármacos como alternativa terapêutica para a criptococose

Abstract

Cryptococcus neoformans é uma das leveduras responsáveis pelo desenvolvimento da meningite criptocócica, importante infecção oportunística em imunocomprometidos, a qual corresponde à terceira complicação neurológica mais comum em portadores do vírus HIV. O tratamento padrão com anfotericina B e fluconazol é efetivo em 50% a 80% dos casos, sendo a sua toxicidade e o desenvolvimento de resistência problemas recorrentes. Assim, destaca-se a necessidade pela busca de novos alvos e fármacos para o tratamento da meningite criptocócica. A reposição de fármacos já utilizados na clínica, que demonstram atividade antifúngica, como a amiodarona e outros bloqueadores de canais de cálcio, mostram-se promissores. Considerando a importância do armazenamento intracelular de cálcio mediado por transportadores deste metal na virulência de C. neoformans, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a utilização de fármacos com mecanismo de ação baseado no bloqueio de canais de cálcio como alternativa terapêutica para a criptococose. Os valores da concentração inibitória mínima (MIC) foram determinados pelo método de microdiluição utilizando linhagens mutantes nulas para os transportadores de cálcio Pmc1 e Vcx1. As linhagens selvagem H99 e complementada pmc1::PMC1 apresentaram MIC para amiodarona de 12,5 μg/mL, enquanto que os mutantes nulos pmc1, vcx1 e pmc1vcx1 apresentaram uma maior sensibilidade, tendo MICs de 6,25 μg/mL. O sinergismo entre a amiodarona e o fluconazol foi avaliado pelo método checkerboard, no qual todas as linhagens obtiveram um índice FIC que indica sinergismo entre os fármacos. Os fármacos verapamil e diltiazem não demonstraram efeito antifúngico, não sendo possível encontrar efeito sinérgico com o fluconazol. Dois importantes fatores de virulência de C. neoformans, a formação da cápsula polissacarídica e a produção de melanina foram avaliados em meio mínimo e meio com asparagina suplementado com L-DOPA, respectivamente. Esses fatores não foram afetados pela adição de amiodarona ao meio, apenas houve um pequeno aumento na formação da cápsula polissacarídica na linhagem complementada pmc1::PMC1. Os níveis de cálcio intracelular, determinados pelo marcador Fura-2 AM, não foram afetados pela adição de amiodarona. A expressão relativa de importantes genes na via mediada por Ca2+-calcineurina foram avaliados por RT-qPCR. CRZ1 e ECA1 apresentaram expressão diminuída na presença de amiodarona na linhagem mutante pmc1. Esses dados reforçam a possibilidade de fármacos bloqueadores de canais de cálcio serem utilizados na clínica combinados com fluconazol, estimulando novas possibilidades de tratamento para a meningite criptocócica.

Cryptococcus neoformans is one of the yeasts responsible for cryptococcocal meningoencephalitis, an important opportunistic infection in immunocompromised individuals that corresponds to the third most common neurological complication in AIDS patients. The recommended treatment with amphotericin B and fluconazole is 50% to 80% effective, with toxicity and resistance as recurrent problems. This indicates the importance of searching for new targets and drugs for the treatment of meningoencephalitis. Re-purposing drugs already used in the clinic that demonstrate antifungal activity have proved promising, such as amiodarone and other calcium channel blockers. Considering the importance of calcium storage mediated by calcium transportes on the cryptococcal virulence, the aim of this study was to evaluate the use of calcium channel blockers drugs as an alternative therapy for cryptococcosis. The values of minimum inhibitory concentration (MIC) were determined by broth microdilution test using null mutant strains for calcium transporters Pmc1 and Vcx1. The wild-type H99 and complemented pmc1::PMC1 strains presented MIC for amiodarone of 12,5 μg/mL, while the mutant strains pmc1, vcx1 and pmc1vcx1 showed more sensitivity, with a MIC of 6,25 μg/mL. The synergy between amiodarone and fluconazole was evaluated by the checkerboard method in which all the strains had a FIC index that indicates synergy between the drugs. The drugs verapamil e diltiazem did not showed antifungal activity nor demonstrated synergy with fluconazole. Two important C. neoformans virulence factors, capsule formation and melanin production, were evaluated in minimal medium and asparagine medium supplemented with L-DOPA, respectively. These factors were not affected by addition of amiodarone in the medium, showing only a slight increase in capsule formation in complemented strain pmc1::PMC1. The levels of intracellular calcium were determined by the dye Fura-2 AM. No significant differences were found after amiodarone addition. The relative expression of important genes in the calcium-calcineurin signaling pathway were evaluated by RT-qPCR. CRZ1 and ECA1 showed decreased expression in the mutant strain pmc1 caused by amiodarone presence. These data support the possibility of calcium channel blockers being used in combination with fluconazol, stimulating new possibilities for treating meningoencephalitis.