Caracterização molecular de isolados da família Enterobacteriaceae produtores da β-Lactamase OXA-370

Abstract

Base teórica: As carbapenemases são β-lactamases capazes de hidrolisar os carbapenêmicos, importante opção terapêutica nas infecções causadas por enterobactérias. A carbapenemase OXA-48 e suas variantes estão entre as principais carbapenemases encontradas em Enterobacteriaceae disseminadas em todo o mundo. A OXA-370, que difere da OXA-48 por um único aminoácido, foi detectada pela primeira vez em 2013 na cidade de Porto Alegre, e até o momento só há relatos de sua detecção no Brasil. Objetivos: Caracterizar isolados produtores de OXA-370 quanto ao perfil de sensibilidade aos β-lactâmicos, sobretudo carbapenêmicos, e investigar o contexto genético em que o gene blaOXA-370 está inserido. Métodos: Foram avaliados isolados obtidos a partir de um estudo de vigilância para o monitoramento de enterobactérias com sensibilidade reduzida aos carbapenêmicos. A detecção dos genes de carbapenemases (blaIMP, blaKPC, blaGES, blaNDM, blaOXA-48-like e blaVIM) foi realizada por PCR Real Time HRM. Os isolados positivos para blaOXA-48-like foram confirmados por PCR convencional e os produtos foram purificados e sequenciados. A relação clonal dos isolados produtores de OXA-370 foi avaliada pela técnica de macrorrestrição do DNA seguido de PFGE e as concentrações inibitórias mínimas (CIMs) foram analisadas por E-test® e/ou microdiluição em caldo. Os plasmídeos foram extraídos por lise alcalina e inseridos em Escherichia coli TOP10 por eletroporação. Bibliotecas de DNA plasmidial foram preparadas utilizando-se o kit Nextera DNA e a seguir foram sequenciadas no sistema MiSeq. As sequências foram montadas utilizando-se o programa SeqMan NGen e os contigs foram alinhados utilizando-se o SeqMan Pro. A plataforma RAST foi utilizada para anotação automática das sequências e a curadoria manual foi realizada utilizando-se o programa ARTEMIS. As sequências completas dos plasmídeos foram comparadas as disponíveis no GenBank utilizando-se o BLAST. As sequências de nucleotídicas dos plasmídeos foram alinhadas utilizando-se o BioEdit. Resultados: Um total de 4.451 enterobactérias foram avaliadas, provenientes de 28 hospitais do Rio Grande do Sul no período de abril de 2013 a abril de 2015. O gene blaOXA-48-like foi detectado em 74 (2,5%) isolados não sensíveis a pelo menos um dos carbapenêmicos. Quanto à distribuição segundo a gênero e/ou espécie, o gene foi detectado em Enterobacter spp. (44,6% complexo E. cloacae e 2,7% E. aerogenes) e 7 Klebsiella spp. (31,1% K. pneumoniae e 6,7% K. oxytoca), seguido por Escherichia coli, (6,7%), Morganella morganii, (2,7%), Citrobacter freundii (1,3%), Proteus mirabilis (1,3%), Providencia stuartii (1,3 %) e Serratia spp. (1,3%). Estes isolados foram provenientes de cinco hospitais, sendo 67 (90,5%) do hospital onde o gene blaOXA-370 foi detectado pela primeira vez. O sequenciamento de blaOXA-48-like foi realizado em 52 isolados, incluindo E. cloacae, E. aerogenes, K. pneumoniae, K. oxytoca, E. coli e C. freundii; todos apresentando 100% de identidade com blaOXA-370. A PFGE revelou a presença de clones distintos entre K. pneumoniae, E. cloacae, K. oxytoca e E. coli. As taxas de susceptibilidade ao meropenem, imipenem e ertapenem entre os isolados produtores de OXA-370 foram 92,3%, 78,8% e 7,7%, respectivamente; a CIM50/CIM90 foram 0,38/2 mg/L e 1/3 mg/L para meropenem e imipenem, respectivamente. Um total de seis plasmídeos tiveram suas sequências nucleotídicas completas determinadas. Todos eram circulares e o conteúdo de GC variou entre 46,7 e 47,2%. Os plasmídeos sequenciados pertencem ao grupo de incompatibilidade IncX e apresentam tamanho aproximado a 70kbp. Além de blaOXA-370 e genes de mobilização, os plasmídeos albergavam também blaCTX-M-8. A análise das sequências mostrou que blaOXA-370 está localizado em um transpóson composto, contendo quatro genes que codificam transposases, designado Tn6435. Conclusão: Em geral, a análise de susceptibilidade antimicrobiana sugere que a presença de OXA-370 não acarreta impacto significativo no perfil de sensibilidade aos carbapenêmicos meropenem e imipenem nos isolados de enterobactérias avaliados neste estudo. Além disso, foi possível observar que o gene blaOXA-370 está disseminado entre diversas espécies e clones de Enterobacteriaceae, indicando um alto potencial de disseminação. Por meio da análise da sequência de plasmídeos carreadores de blaOXA-370 foi possível identificar um novo elemento genético móvel, designado transpóson Tn6435, o qual está associado a disseminação de OXA-370 em isolados de enterobactérias no Rio Grande do Sul.

Background: Carbapenemases are β-lactamases capable of hydrolyzing carbapenems, an important therapeutic option in infections caused by enterobacteria. OXA-48 carbapenemase and its variants are among the major carbapenemases found in Enterobacteriaceae worldwide. OXA-370, which differs from OXA-48 by a single amino acid, was detected for the first time in 2013 in the city of Porto Alegre, and until the moment there are only reports of its detection in Brazil. Objectives: To characterize OXA-370 isolates in relation to the β-lactam susceptibility profile, especially carbapenems, and to investigate the genetic context in which the blaOXA-370 gene is inserted. Methods: Isolates obtained from a surveillance study for the monitoring of enterobacteria with reduced sensitivity to carbapenems were evaluated. Detection of the carbapenemases genes (blaIMP, blaKPC, blaGES, blaNDM, blaOXA-48-like and blaVIM) was performed by Real Time HRM PCR. blaOXA-48-like positive isolates were confirmed by standard PCR and the products were purified and sequenced. The clonality of OXA-370-producing isolates was evaluated by the DNA macrorestriction followed by PFGE and the minimum inhibitory concentrations (MICs) were analyzed by E-test® and / or broth microdilution. Plasmids were extracted by alkaline lysis and inserted into Escherichia coli TOP10 by electroporation. Plasmid DNA libraries were prepared using the Nextera DNA kit and then sequenced in the MiSeq system. Sequences were assembled using the SeqMan NGen program and the contigs were aligned using SeqMan Pro. The RAST platform was used for automatic annotation of sequences and manual curation was performed using the ARTEMIS program. The complete sequences of the plasmids were compared to those available on GenBank using BLAST. The nucleotide sequences of the plasmids were aligned using BioEdit. Results: A total of 4,451 enterobacteria from 28 hospitals in Rio Grande do Sul were evaluated from April 2013 to April 2015. The blaOXA-48-like gene was detected in 74 (2.5%) isolates non-susceptible to at least one of the carbapenems. Regarding the distribution according to genus and / or species, the gene was detected in Enterobacter spp. (44.6% E. cloacae complex and 2.7% E. aerogenes) and Klebsiella spp. (31.1% K. pneumoniae and 6.7% K. oxytoca), followed by Escherichia coli (6.7%), Morganella morganii (2.7%), Citrobacter freundii (1.3%), Proteus mirabilis (1.3%), Providencia stuartii (1.3%) and Serratia spp. (1.3%).