Otimização de método de extração de DNA total de bactérias para a detecção de genes de resistência a antimicrobianos, em amostras ambientais de água, através da reação em cadeia da polimerase (PCR)

Abstract

A contaminação dos ecossistemas naturais por fármacos é reconhecida como um dos principais problemas emergentes em química ambiental. Os antimicrobianos, em particular, despertam grande preocupação porque podem alterar a dinâmica populacional de microrganismos, incluindo a seleção de resistência, com potenciais consequências para a saúde humana. Recentemente, foi relatada a presença de fármacos antimicrobianos, na faixa de ng.L−1, em águas residuais e em águas superficiais de Porto Alegre, o que levou à preocupação quanto ao risco de desenvolvimento de resistência bacteriana, especialmente em pontos de captação de água para consumo humano. Neste contexto, o objetivo principal desse trabalho consiste na otimização e aplicação de um método in house de extração de DNA total (DNAT) de linhagens de microrganismos modelo, bem como, de amostras ambientais, para posterior estudo de um gene de resistência a antimicrobianos β-lactâmicos (blaTEM-1), por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para o desenvolvimento da metodologia, foram utilizadas duas cepas da espécie Escherichia coli, a E. coli ATCC 11775T, que é suscetível ao antimicrobiano β-lactâmico ampicilina e a E. coli Top10, resistente à ampicilina. A partir de cultivos dessas cepas realizaram-se extração de DNAT, por método de extração orgânica com fenol:clorofórmio, e extração de DNA plasmidial (DNAP), por método de lise alcalina. Na extração de DNAT, foram testadas três formulações de tampão de lise celular: TESA, TESB e TET. Os produtos de extração de DNAT e DNAP foram analisados por eletroforese em gel de agarose e amostras de DNAT foram quantificadas por método fluorimétrico. As amostras de DNAT e DNAP das E. coli ATCC 11775T e Top10 foram submetidas à técnica de PCR. Foram testados dois pares de primers universais para o gene bacteriano rRNA 16S e um par de primers para detecção do gene blaTEM-1. Posteriormente, foram coletadas amostras de águas superficiais em seis pontos do Arroio Dilúvio. Para concentrar células bacterianas, as amostras foram filtradas à vácuo em membranas de 0,22 μm. A partir das membranas, realizou-se extração de DNAT, pelo método do fenol:clorofórmio, com duas formulações de tampão de lise celular, TESA e TET, e condições variadas de incubação. A partir da análise dos géis de agarose, podem-se observar bandas compatíveis com DNA genômico nas amostras das duas cepas, e bandas compatíveis com DNA plasmidial apenas para a cepa E. coli Top10. As formulações TESA e TESB foram igualmente eficazes na extração de DNAT, e TET não produziu resultados. O rendimento médio das extrações de DNAT foi de 0,028 μg/μL, quantidade suficiente para amplificação por PCR. Os produtos de PCR obtidos com os pares de primers que amplificam o gene rRNA 16S apresentaram o tamanho esperado nas amostras de E. coli ATCC 11775T e Top10. Bem como, foram obtidos amplicons de tamanho esperado com o par de primers blaTEM-F e blaTEM-R nas amostras de E. coli ATCC 11775T e Top10, sendo as bandas mais intensas para E. coli Top10. Verificou-se, ainda, a partir da extração de DNAT dos microrganismos das amostras de água, a presença de bandas de DNA com parcial degradação quando utilizou-se o tampão TESA e nenhum DNA utilizando-se o tampão TET. Pode-se concluir, portanto, que a otimização de um método in house de extração de DNAT a partir de cultivos de microrganismos foi realizada com sucesso, obtendo-se DNA em quantidade e qualidade suficiente para a técnica de PCR. A cepa E. coli Top10 apresenta potencial para ser utilizada como um controle positivo no estudo do gene blaTEM-1. O método in house de extração de DNAT a partir de amostras ambientais, no entanto, ainda requer otimização.