Modulação do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) em sarcoma de Ewing : impacto na viabilidade, proliferação celular e vias de sinalização associadas a neurotrofinas

Abstract

A família de Tumores de Ewing pode ser compreendida como um espectro de neoplasias de células neuroectodérmicas primitivas, dentre eles se inclui uma classe menos diferenciada chamada Sarcoma de Ewing (SE), no qual o diagnóstico é mais frequente entre 11 e 20 anos. O índice de sobrevida pode chegar em 70%; todavia, estima-se que apenas 55% dos pacientes recebam um tratamento efetivo. Alguns estudos sugerem relevância do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) no processo de tumorigênese e metátase em cânceres de cabeça e pescoço, pulmão e colorretal. Algumas vias de sinalização que poderiam explicar a relação do EGFR a estes processos incluem a MAPK/ERK e PI3K/AKT. No entanto, estes complexos de sinalização podem ser ativados por outras cascatas de transdução de sinal como do sistema BDNF/TrkB. As neurotrofinas, mais recentemente, estão sendo relacionadas ao processo tumoral. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a importância de EGF/EGFR na progressão tumoral do Sarcoma de Ewing, bem como o crosstalking entre este sistema e neurotrofinas. Linhagens celulares foram expostas a EGF ou ao inibidor da fosforilação do respectivo receptor (AG1478). A viabilidade e proliferação celular foram avaliadas em hemocitômetro. A análise do ensaio clonogênico foi feita em software ImageJ®. Para análise do ciclo celular, após exposição ao AG1478, realizou-se a avaliação por citometria de fluxo e uma provável indução de senescência foi analisada com X-Gal. Western Blotting foi padronizado para avaliação das vias MEK/ERK, PI3K/AKT, Ciclina D1, p53 e BDNF quando da exposição ao AG1478. Análises de viabilidade celular também foram feitas usando inibidores de MEK ou PI3K em combinação ao AG1478 ou não. A exposição das linhagens SK-ES-1 E RD-ES ao EGF afeta positivamente a taxa de proliferação destas e, quando essas são tratadas com o inibidor AG1478, existe um decréscimo desta taxa além de um impacto da razão de viabilidade. O índice de citotoxicidade (IC50) resultante é de 12,8uM e 9,8uM para SK-ES-1 e RD-ES, respectivamente. Foi observado que a inibição de EGFR reduziu o número e tamanho de colônias, e que a sua ativação reflete em um aumento dos parâmetros. Alterações das porcentagens populacionais nas fases do ciclo celular foram observadas. O ensaio colorimétrico mostrou aumento da percentagem de células senescentes e sugere-se envolvimento da via da ERK; AKT; Ciclinas, P53 e BDNF no efeito mediante exposição ao AG1478. A exposição ao EGF, portanto, aumenta a proliferação e a clonogenicidade de células de SE, bem como a diminuição destas quando da inibição do receptor. Também, a inibição de EGFR resulta em alterações no ciclo celular, senescência e morte celular.

The family of Ewing's tumors may be understood as a spectrum of primitive neuroectodermal cell neoplasms, including a less differentiated class called Ewing's sarcoma (ES), wherein the diagnosis is most common between 11 and 20 years. The survival rate can reach 70%; however, it is estimated que only 55% of Patients receive effective treatment. Some published studies suggest relevance of epidermal growth factor receptor (EGFR) in tumorigenesis and metastatic process in head and neck, lung and colorectal tumors. Some signaling pathways, which could explain its relation with these processes, include MAPK / ERK and PI3K / AKT. However, other signal transduction cascades such as BDNF / TrkB system may activate these signaling complexes, the neurotrophins being related to the tumoral process. This study aims to assess the importance of EGF / EGFR in Ewing's Sarcoma tumor progression, and the crosstalking between this system and neurotrophins. Cell lines were exposed to EGF or the inhibitor of phosphorylation of its receptor (AG1478). The viability and cell proliferation were evaluated in hemocytometer. The analysis of the clonogenic assay was performed in ImageJ® software. For cell cycle analysis after exposure AG1478, the evaluation was performed by flow cytometry and a probable induction senescence was analyzed with X-Gal. Western Blott was standardized to evaluate the pathways MEK / ERK, PI3K / AKT, cyclin D1 and P53 when exposure to AG1478. Cell viability analyzes were also performed on exposure to MEK and PI3K inhibitor in combination or not with AG1478. Exposure of SK-ES-1 and RD-ES lines to EGF positively affects the rate of proliferation and when these are treated with the inhibitor AG1478, there is a decrease in this rate as well as an impact reason viability. The cytotoxicity index (IC50) is 12,8uM resulting 9,8uM and SK-ES-1 and RD-ES, respectively. We observed that inhibition of EGFR reduced the number and size of colonies, and their activation reflects an increase in the parameters. Changes in population percentages in the cell cycle phases were observed. The colorimetric assay showed an increased percentage of senescent cells and it is suggested involvement of the ERK pathway; AKT; Cyclin P53 and the effect upon exposure AG1478. Therefore, the EGF exposure increases the proliferation and clonogenicity of ES cells, as well as the reduction is observed when these receptor inhibited. Also, inhibition of EGFR results in changes in the cell cycle, senescence and cell death.