Alterações hepáticas causadas pelo etanol e efeito do tratamento com Lactobacillus rhamnosus GG em zebrafish (Danio rerio)

Abstract

Introdução: Em relação ao fígado, a esteatose é a consequência mais comum do consumo abusivo do etanol e predispõe à doença hepática mais grave. Os mecanismos da doença hepática alcoólica não são plenamente conhecidos e as terapias são escassas. Os objetivos desta tese foram: 1) averiguar os efeitos do etanol no fígado, utilizando o zebrafish como modelo experimental; 2) avaliar o tratamento com o Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) na esteatose hepática; 3) observar os efeitos do etanol e do tratamento com o LGG no comportamento do zebrafish. Métodos: Foram realizados três experimentos utilizando peixes zebrafish, adultos, wildtype. O primeiro experimento foi formado por dois grupos, Controle (C) e Etanol (E), com 52 animais em cada um. O grupo E foi exposto a 0,5% de etanol por quatro semanas. Foram conduzidas análises histológicas e moleculares dos genes il-1b, tnf-α, il-10, sirt1, adiponectina e adipor2 nos fígados dos animais. No 2°experimento foram avaliados quatro grupos: Controle (C), Probiótico (P), Etanol (E) e Probiótico + Etanol (P + E), com 220 animais respectivamente. Durante quatro semanas os grupos P + E e P foram alimentados com ração com o probiótico LGG e os grupos E e C com ração sem probiótico. Foram realizadas análises histológicas e morfométricas no tecido hepático, quantificações de lipídeos séricos e hepáticos. No 3° experimento, os grupos C, E, P e P+E foram formados (n=15 animais por grupo) e, após duas semanas, o comportamento dos animais foi analisado no teste open-tank com o programa ANYmaze ®. Resultados: No 1° experimento os animais do grupo E apresentaram intensa esteatose hepática, aumento de glicogênio plasmático associado às gotículas lipídicas, alterações no retículo endoplasmático rugoso e degeneração de canalículos biliares. Houve acentuação na expressão hepática de il-1b, tnf-α, sirt1 e do adipor2, indicando que o etanol desencadeou resposta inflamatória e de proteção hepática. No 2° experimento, o grupo E apresentou intensa esteatose após quatro semanas, ao contrário do grupo P + E. A morfometria celular mostrou um aumento de 14,8 vezes no tamanho dos hepatócitos do grupo E (4° semana) quando comparado com C (p <0,0001). Os triglicerídeos séricos diminuíram no grupo P + E em comparação com C, P (p <0,001) e E (p = 0,004). O colesterol sérico do grupo P diminuiu comparado aos grupos C e E na segunda semana (p = 0,002 e p = 0,007) e do grupo P + E diminuiu comparado aos grupos E e C (p<0,0001), na quarta semana. As concentrações de triglicerídeos hepáticos reduziram no grupo P + E na quarta semana em comparação com E (p = 0,006). No 3° experimento, os animais expostos ao etanol apresentaram menor ansiedade em relação ao novo ambiente, evidenciada pela maior exploração da área superior do aquário. O efeito desibinidor do etanol não foi significativamente atenuado pelo tratamento com o LGG. Conclusões: Os resultados do primeiro estudo indicaram que o etanol desencadeia uma série de eventos celulares e moleculares e que a inflamação desempenha papel significativo na esteatose hepática. No segundo, foi demonstrado que o tratamento com LGG diminuiu os níveis séricos de triglicerídeos e de colesterol, atenuando a esteatose hepática. O terceiro estudo mostrou que o etanol teve efeito significativo no comportamento do zebrafish, que não foi modificado pelo LGG.

Introduction: Regarding to the liver, hepatic steatosis is the most common consequence of abusive alcohol consumption and predisposes to more severe liver disease. The mechanisms of alcoholic liver disease are not fully known and therapies are scarce. The objectives of this thesis were: 1) to verify the effects of ethanol in the liver using the zebrafish as an experimental model; 2) to evaluate a treatment with the probiotic Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) in hepatic steatosis; 3) to observe the effects of ethanol and treatment with LGG in zebrafish behavior. Methods: Three experiments were performed using zebrafish, adult, wildtype. For the 1st trial, two groups were formed: Control (C) and Ethanol (E), with 52 animals in each group. E group was exposed to 0.5% ethanol during four weeks. Histological and molecular analysis of genes il-1b, tnf-α, il-10, sirt1, adiponectin, and adipor2 were conducted in zebrafish livers. For the 2nd trial, four groups were evaluated: Control (C), Probiotic (P), Ethanol (E) and Probiotic + Ethanol (P + E). During four weeks, the P + E and P groups were fed with food supplemented with LGG and E and C groups received food without probiotic. Histological and morphometric analysis in liver tissue, measurements of serum and hepatic lipids were performed. In the 3rd trial, C, E, P and P + E groups were formed and after two weeks, the animals' behavior was analyzed in opentank test with ANYmaze ® program. Results: In the 1st trial, animals in E group developed severe liver steatosis and cell abnormalities were observed: increase of glycogen associated to lipid droplets, alterations in the rough endoplasmic reticulum, degeneration of biliary canaliculi with presence of myelin figures inside. Increased hepatic expression of il-1b, tnf-α, sirt1 and adipor2 possibly indicates that ethanol triggered both inflammatory and hepatic protection responses. In the 2nd trial, E group presented severe steatosis after four weeks, in contrast to the E + P group. Cell morphometry showed a 14.8 fold in hepatocytes size of E (4th week) compared to C group (p <0.0001). Serum triglycerides decreased in the P + E group compared with C, P (p <0.001) and E groups (p = 0.004). Serum cholesterol decreased in P group compared to C and E groups at second week (p = 0.002 and p = 0.007) and in E + P group decreased compared with E and C groups (p<0.0001) at fourth week. Liver triglycerides were reduced in the P + E group at the fourth week compared to E group (p = 0.006). In the 3rd trial, there was an alteration in the behavior of animals exposed to ethanol compared to that nonexposed, an effect not significantly attenuated by treatment with LGG. Conclusions: Results of the first study indicate that ethanol triggers a series of cellular and molecular events and inflammation plays a significant role in hepatic steatosis. Then, it was shown that treatment with LGG decreased serum levels of triglycerides and cholesterol, attenuating hepatic steatosis. The third study showed that the ethanol, but not LGG has a significant effect on zebrafish behavior.