Expressão imuno-histoquímica de P16 INK4A, K167 e receptores de estrogênio e progesterona em lesões do colo uterino, sua associação com infecção pelo papilomavirus humano e seus correlatos epidemiológicos

Abstract

Introdução: Estudos epidemiológicos demonstram que cerca de 99,0% dos carcinomas cervicais estão associados à infecção persistente por alguns tipos de Papilomavírus Humano (HPV). O longo período de latência a partir da infecção primária e o aparecimento de lesões sugerem que fatores adicionais, como início precoce das relações sexuais, número de parceiros, tabagismo, uso de hormônios, presença de co-infecções, estejam envolvidos no processo de carcinogênese. A co-infecção por Chlamydia trachomatis (CT) tem sido sugerida, como um fator contribuinte na patologia cervical. A detecção precoce das lesões e o grau histológico são fundamentais, mas às vezes, difícil. O emprego de marcadores prognósticos, através da técnica de imuno-histoquímica possibilita esclarecer e complementar resultados controversos de citologia e de biópsias. Objetivos: Verificar a presença de infecção pelo Papilomavírus humano, tipos de alto risco, a presença de co-infecção por CT, associação com as características epidemiológicas, bem como, identificar a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a, Ki67, receptores de estrogênio e progesterona em lesões pré-neoplásicas e neoplásicas de cérvice uterina. Métodos: Um estudo transversal envolvendo mulheres assintomáticas foi desenvolvido entre fevereiro de 2003 e janeiro de 2006 em uma Unidade de Atenção Primária à Saúde em Porto Alegre – RS, Brasil para verificar a prevalência de infecção pelo HPV, tipos -16, -18, -31 e de CT. Um total de 89 participantes respondeu a um questionário epidemiológico padronizado sobre as características demográficas, hábitos pregressos, história reprodutiva e de comportamento sexual. A pesquisa de DNA-HPV, tipos de alto risco, bem como a presença de DNA-CT foi identificada através da técnica da Reação da Polimerase em Cadeia (PCR). Após examecolposcópico, foi coletada biópsia para avaliação imuno-histoquímica empregando os marcadores p16INK4a, Ki67, receptores hormonais de estrogênio e progesterona. RESULTADOS: A presença de DNA-HPV foi identificada em 83,0% (74/89) das biópsias, sendo que 46,0% (34/74) eram portadoras de HPV de alto risco. O DNA-CT foi presente em 16/86 pacientes testadas (19,0%). Quanto ao exame anatomopatológico (AP), 7,0% eram lesões de alto grau, 59,0% de baixo grau e em 34,0% não foram observadas alterações. A expressão de p16INK4a foi observada em 85,3% (29/34) das mulheres positivas para DNA-HPV-AR e esta associação foi estatisticamente significativa (p=0,02), sendo que, todas as biópsias, positivas para HPV-16 (16/34), expressaram a proteína (p=0,01). Houve uma associação estatisticamente significativa entre a intensidade de expressão, o padrão de expressão de p16INK4a e o grau da lesão (p= 0,001). A associação entre a expressão de p16INK4a e DNA-HPV se mostrou estatisticamente significativa entre fumantes (p=0,03; OR: 11,25 IC95%:1,11-114,4), entre mulheres com história prévia de DST (p=0,01; OR: 6,82 IC95% 1,53-30,3), com sexarca entre17-19 anos (p=0,048; OR: 8,500 IC95% 0,971-74,424) e em mulheres com três ou mais parceiros sexuais ao longo da vida (p=0,02; OR: 8,12 IC95%: 1,31-50,2). Todas as mulheres positivas para DNA-CT foram positivas para DNA-HPV. Entre as portadoras de co-infecção, 56,0% expressaram a p16INK4a (OR=0,51, IC95%: 0,17-1,57. Para Ki67, todas as lesões de alto grau, 50,0% das lesões de baixo grau e 31,0% das biópsias negativas expressaram o mesmo (p=0,004). Para as pacientes portadoras de DNA-HPV, o Ki67 foi expresso em 100,0%, 31,0% e 32,0% das lesões de alto grau, baixo grau e fragmentos normais, respectivamente, apresentando uma associação estatisticamente significativa (p<0,003). Não foi observada associação entre a expressão do receptor de estrogênio e os desfechos estudados. Já, o receptor de progesterona foi expresso em 42,0% (37/89) dos casos estudados e, 26,5% (9/37) eram positivas para os tiposvirais de alto risco (p=0,023). A expressão do receptor de progesterona foi maior em nãofumantes (p=0,02), entre as mulheres que utilizavam anticoncepcional oral (p=0,03) e que tinham um menor grau de escolaridade (p=0,04). Discussão e conclusões: A presença da infecção persistente pelo HPV em lesões cervicais nos diferentes graus histológicos é fato já demonstrado. A atividade transformadora do vírus, especialmente com a expressão de oncoproteínas virais, facilita a de replicação e a diferenciação do epitélio após a sua integração no genoma hospedeiro. Desta forma, a identificação dos tipos virais de alto risco é essencial para se estabelecer e avaliar o prognóstico das lesões e a expressão imuno-histoquímica de p16INK4a e Ki67 podem confirmar resultados citológicos suspeitos. A co-infecção por CT, descrita em diversos estudos epidemiológicos, tem sido relatada como um fator de risco para a infecção por HPV, bem como o desenvolvimento de lesões mais agressivas. Entretanto, em nosso estudo, não foi encontrada associação entre os desfechos e a infecção por CT, exceto para pacientes com menor grau de escolaridade, provavelmente, em virtude do pequeno tamanho da amostra. Observa-se, através desta análise, a contribuição da técnica de imuno-histoquímica e de marcadores de oncogenicidade, como a p16INK4a e do Ki67 no diagnóstico das lesões ativas. A associação das variáveis epidemiológicas com estes marcadores se mostrou efetiva, já que existem evidências de que alguns destes podem facilitar e contribuir para o desenvolvimento destas lesões.

Introdution: Epidemiological studies have shown that about 99.0% of cervical carcinomas are related to persistent infection caused by some human papillomavirus (HPV) types. The large latency period since primary infection and the appearance of lesion suggests that adicional factors such as age at first intercourse, number of sexual partners, smoking, oral contraceptive use and other factors are involved in the carcinogenesis process. Among this, the co-infection by Chlamydia trachomatis (CT) have been sugested by some authors as a contributor factor in the cervical patology. The precoce detection of lesions and the histological grade are important, but sometimes difficult. The use of prognostic markers through immunohistochemical technic clarify and complement controversial results in citology. Objetives: Verifing the presence of Human papillomavirus infection, high – risk subtypes, the presence of CT co-infection, and the association with the epidemiological factors as well as identifying the immunoistochemical expression of p16INK4a, Ki67, and estrogen and progesterone receptors in pre-neoplastic and neoplastic lesions of uterine cervix. . Materials and methods: A cross-sectinal study with assintomatic women was conducted between february 2003 and december 2006 in a primary care unit in Porto Alegre- RS, Brazil to verify the prevalence of Papillomavirus infection, sub-types -16,18,31 and CT infecttion. The participants answered a questionaire about sociodemographic characteristics, former habits, reproductive history and sexual behaviour.The high-risk DNA-HPV subtypes reserach (HPV - 16,-18,-31) and the presence of DNA-Chlamydia trachomatis (CT) was identified through Polimerase Chain Reation Technique (PCR). After colposcopi examination, was collected biopsy for immunohistochemical analysis of p16INK4a, Ki67, estrogen and progesterone receptors. RESULTS: The DNA-HPV was observed in 83% (74/89) biopsies and 46% (34/74) were highrisk types (16,18,31). DNA-CT was detected in 16/86 patients (19%). In relation to anatomopathological exam, 7% were high-squamous intraepithelial lesion (HSIL), 59% low squamous intraepithelial lesion (LSIL) and in 34% no was observed alterations. The expression of p16INK4a was observed in 85,3% (29/34) positive women to DNA-HPV HR and this association was statistically significant (p=0,02). All biopsies HPV-16 positive (16/34) expressed p16INK4a (p=0,01). There was a significant association between intensity, pattern of expression and grade of lesion (p=0,001). The association between p16INK4a expression and DNA-HPV was statistically significant in smokers (p=0,03; OR: 11,25 IC95%:1,11-114,4), in women with previous history of sexual transmitted disease (SDT) (p=0,01; OR: 6,82 IC95% 1,53-30,3), women withbthe first intercourse between 17-19 years (p=0,048; OR: 8,500 IC95% 0,971- 74,424) and in women with three or more lifetime sexual partners (p=0,02;OR 8,12 IC95%:1,31- 50,2). Women positive to DNA-CT were positive to DNA-HPV. Between women DNA-HPV positive, the antibody Ki67 was expressed in 100%, 31% and 32% of HSIL, LSIL and normal fragments respectively and this association was statisticaly significative (p<0,003). No association was observed between the estrogen receptor expression and the outcomes studied. The progesterone receptor was expressed in 42% of cases studied (37/89), and 26,5% (9/37) was positive for high-risk types (p=0,023). The progesterone receptor expression was greater in nosmokers (p=0,02), between women who use oral contraceptives (p=0,03) and that have lower school-grade (p=0,04). Discussion and conclusion: The presence of HPV persistent infection in cervical lesions in different histological grades is fact already demonstrated. The virus transforming activity is in accordance with its capacity of replication and the diferentiation through epiteliaafter its integration. The identification of high types of virus is essential to establish and evaluate the prognosis of lesions. The co-infection with CT described in several epidemiological studies has been related as a risk factor to acquire the HPV infection and to develop more agressive lesions. Howevwer in our study except in relation to lower school grade no association was observed between the outcomes and the co-infection by CT, probably due to the small sample. It observed trough this study, the contribution of the immunohistochemical analysis of concogenic markers suh as p16INK4a and Ki67 expression in the diagnostic and follow-up of active lesions. The associaton of epidemiological variables with these markers showed efficient, and evidence existe that some variables can contribute to lesions transformation.