Transdução gênica por via endoscópica com expressão de Ad5E1RSVhIL-10 em transplante pulmonar em animais de grande porte

Abstract

No presente estudo, procurou-se investigar a aplicação terapêutica potencial de AdhIL-10 em um modelo de transplante em grandes animais, buscando-se avaliar a quantidade necessária de hIL-10 transferida aos pulmões para se ter uma resposta eficiente mensurável e clinicamente relevante. Mostrou-se, inicialmente, que a transfecção de 4x1010 pfu/ml de Ad5E1RSVhIL-10 em pulmão esquerdo logrou alcançar tal objetivo(p<0.001). Numa segunda etapa, 2 estudos foram desenvolvidos. Estudo A - 15 animais foram alocados aleatoriamente em 3 grupos: 1- diluente (CONTROLE, n=5), 2- vetor vazio (VV, n=5), e 3- Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). A AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) foi administrada ao doador por via endobrônquica, usando-se um broncoscópio flexível, e os animais foram ventilados por 12h antes da retirada dos pulmões. Os pulmões foram então armazenados por 18h antes de serem transplantados, e os parâmetros fisiológicos foram seguidos por 2h depois da reperfusão. Estudo B - também foram alocados randomicamente 7 animais em 2 grupos: diluente (CONTROLE, n=3), e Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). A administração foi realizada do mesmo modo descrito previamente, os animais foram mantidos acordados e com ventilação espontânea durante 24 horas antes da retirada do órgão. Os pulmões foram a seguir armazenados durante 24 horas então serem transplantados, e avaliados por 2h após a reperfusão. Todas a citocinas foram medidas por ELISA no tecido pulmonar transplantado ao término do tempo de isquemia fria, do tempo de isquemia morna, e depois de 1h e 2h de reperfusão. Os animais doadores toleraram a entrega de gene IL-10 humano via endobrônquica sem incidentes, permanecendo hemodinamicamene estáveis ao longo do período de observação. PaO2 e PaCO2 dos doadores não foram significativamente diferentes entre grupos na hora de retirada do órgão. Depois de 2h de reperfusão, entretanto, o pulmão transplantado mostrou oxigenação arterial sistêmica melhorada em ambos os estudos: 511±71 mmHg em AdhIL-10 versus 256±182 e 423±173 mmHg em VV e CONTROLE, respectivamente (p <0.05 AdhIL-10 versus controle). Além disso, o pico de pressão nas vias aéreas mostrou-se mais baixo (25±0.8 cmH2O em AdhIL-10 contra 30.4±1.6 e 37.3±3.1 cmH2O em VV e CONTROLE, respectivamente), e a relação de peso úmido-seco foi melhorada no grupo AdhIL-10 (6.1±0.6 mg contra 7.5±0.8 e 6.3±0.8 mg em VV e CONTROLE, respectivamente). A expressão de IL-10 humana (hIL-10) foi 35.2±13.4 e 100.1±7.7 pg/mg de proteína 12h e 24h após a transfecção, respectivamente. A expressão gênica de hIL-10 no tecido pulmonar transplantado depois de 2 horas de reperfusão foi 12.4±13.8 pg/mg de proteína no grupo AdhIL-10 (versus 0 e 0 pg/mg de proteína no grupos VV e CONTROLE; p <0.05). No estudo B ocorreram os mesmos achados, considerando-se PaO2: O grupo AdhIL-10 manteve uma oxigenação sangüínea (396±166 mmHg) contra uma baixa oxigenação arterial no grupo de controle (104±38 mmHg); p <0.05). A razão de peso úmido-seco (6.1±0.4 contra 10.1±0.8 mg) e o pico de pressão nas vias aéreas (24.5±4.9 contra 32.1±8.4 cmH2O) mostraram-se ambos significativamente mais baixos no grupo AdhIL-10 (p<0.05). A IL-8 porcina permaneceu estável nos grupos VV (92.41±37.1 e 102.8±130.5 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (106.6±37.5 e 95.6±49.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (94.9±28.7 e 79.5±38.9 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). A IL-6 porcina demontrou uma tendênciaa redução no estudo A, porém sem significado estatístico VV (0.17±0.2 e 129.5±41.4 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente) e CONTROLE (zero e 75.6±49.1 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente); porém, tendeu a diminuir no grupo AdhIL-10 depois da reperfusão (zero e 60.4±51 pg/mg de proteína antes e depois de 2h da reperfusão, respectivamente). No estudo B, a sIL-8 demonstrou uma redução estatisticamente significativa após 2 horas de reperfusão no tecido pulmonar (p<0.02). 171.7±92 pg/mg de proteína no grupo CONTROLE e 56.2±23.5 pg/mg de proteína no grupo AdhIL- 10.Da mesma forma, demonstrou-se uma redução dos níveis de sIL-6 no estudo B 2 horas após a reperfusão pulmonar, tanto no tecido pulmonar (p<0.03), quanto no plasma do receptor( p<0.002).

In the present study, it was tried to investigate the potential therapeutic application of AdhIL-10 in a transplant model in large animals, in order to evaluate the necessary amount of hIL-10 transferred to the lungs to have a measurable and clinically relevant gene transfection. We proved that 4x1010 pfu/ml of Ad5E1RSVhIL-10 into left lung reached this goal (p<0.001).Secondly, we runned 2 studies: study A -15 animals were randomly allocated into 3 groups: 1: diluent (CONTROL, n=5), 2: empty vector (EV, n=5), and 3: Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=5). AdhIL-10 (4x1010 pfu/ml) was administered endobronchially via fiberoptic bronchoscope to the donor and animals were ventilated for 12h prior to lung retrieval. The lungs were then stored for 18h prior to transplantation, and followed by 2h of reperfusion. Study B – 7 animals were also randomly allocated into 2 groups: diluent (CONTROL, n=3), and Ad5E1RSVhIL-10 (AdhIL-10, n=4). The administration was done as the same way described previously, but tha animals were kept awake for 24 hours prior to lung retrieval. The lungs were stored for 24 hours prior to transplatation and followed 2h of reperfusion All cytokines were measured by ELISA in transplanted lung tissue at the end of the warm ischemic time, and after 1h and 2h of reperfusion. Donor animals tolerated the endobronchial gene delivery without incident and remained hemodynamically stable throughout the observation period. Donor PaO2 and PaCO2 were not significantly different between groups at the time of retrieval. After 2h of reperfusion, the transplanted lung showed improved oxygenation in both studies (511±71 mmHg in AdhIL-10 group vs. 256±182 and 423±173 mmHg in EV and CONTROL respectively p<0.05 AdhIL-10 versus control). In addition, the peak airway pressure was lower (25±0.8 cmH2O in AdhIL-10 versus 30.4±1.6 and 37.3±3.1 cmH2O in EV and CONTROL, respectively), and the wet-to-dry weight ratio was improved in the AdhIL-10 group (6.1±0.6 mg versus 7.5±0.8 and 6.3±0.4 in EV and CONTROL, respectively). Human IL-10 (hIL-10) expression was 35.2±13.4 and 100.1±7.7 pg/mg protein after 12h and 24h of transfection, respectively. hIL-10 gene expression in transplanted lung tissue after 2 hours of reperfusion was 12.4±13.8 pg/mg protein in the AdhIL-10 group (vs. 0 and 0 pg/mg in EV and CONTROL groups p<0.05).In study B occurred the same findings regarding PaO2: ;the AdhIL-10 group showed a maintaned blood oxygenation (396±166 mmHg) versus a poored oxygenated arterial blood in CONTROL group (104±38, p<0.05). The wet and dry ratio (6.1±0.4 versus 10.1±0.8) and Peak Airway Pressure (24.5±4.9 versus 32.1±8.4) were lower in AdhIL-10 group (p<0.05). Swine IL-8 remained stable in EV (92.41±37.1 and 102.9±130.5 before and after 2h reperfusion, respectively) and CONTROL (106.6±37.5 and 95.6±49.9 before and after 2h reperfusion, respectively), whereas it tended to decrease in AdhIL-10 group after reperfusion (94.9±28.7 and 79.5±38.9 before and after 2h reperfusion, respectively). Porcine IL-6 had showed a tendency for reduction in the study A, even so without statistical meaning EV (0.17±0.2 and 129.5±41.4 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively) and CONTROL (zero and 75.6±49.1 pg/mg of protein before and after 2 hours of reperfusion, respectively). However, it tended to decrease in the AdhIL-10 group after the reperfusion (zero and 60.4±51 protein pg/mg XVI before and after 2 hours of reperfusion, respectively). In the study B, sIL-8 demonstrated a statistically significant reduction after 2 hours of reperfusion in the lung tissue (p <0.02). 171.7±92 pg/mg of protein in the CONTROL group and 56.2±23.5 pg/mg of protein in the AdhIL-10 group.The same findings, a reduction of the levels of sIL-6 was demonstrated in the study B 2 hours after the lung reperfusion, as much in the lung tissue (p <0.03), as in the plasma of the receptor (p <0.002).