Estudo da expressão da caveolina-1 em células estreladas hepáticas (GRX)

Abstract

A fibrose hepática está entre as doenças que mais causam mortes no mundo, e é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular fibrótica, cuja presença danifica as funções do fígado. As células estreladas hepáticas (HSC) participam ativamente deste processo, modificando seu fenótipo quiescente, rico em lipídios no citoplasma, para o fenótipo ativado, em resposta ao insulto hepático. A fibrose hepática pode causar uma insuficiência hepática e hipertensão portal, causando uma modificação da arquitetura hepática. A linhagem GRX é um modelo de HSC ativadas. As caveolas são pequenas invaginações que ocorrem na membrana plasmática com um tamanho entre 50-100nm. Estas estruturas possuem um formato de U ou vesículas e ocorrem em todos os tipos celulares. As caveolas são caracterizadas como microdomínios de membrana ou rafts lipídicos, que são regiões especialmente ricas em glicoesfingolipídeos, colesterol e proteínas GPI-ancoradas. As caveolas têm importantes papeis na fisiologia das células como: transcitose, endocitose, pinocitose, homeostase do colesterol, rotas de transdução de sinais, migração celular, controle do ciclo celular e polaridade celular. As principais proteínas que compõem as caveolas são da família das caveolinas, sendo a mais importante a caveolina-1 (Cav)-1, que junto com a caveola, desempenha importantes funções na célula. A Cav-1 é uma proteína estrutural de membrana presente em todos os tipos celulares, que estabiliza estes domínios de membrana, contribuindo para a manuntenção de proteínas residentes nas caveolas. Em fígados cirróticos, é encontrado um aumento da expressão da Cav-1 nas células endoteliais sinusoidais e nas HSCs, sugerindo que o aumento da expressão da Cav-1 pode estar relacionado com a hipertensão portal que acompanha o processo de fibrose. No presente trabalho, foi feita uma superexpressão da Cav-1 associada com a proteína fluorescente EGFP através do método de transfecção com o plasmídeo pCavEGFP em células GRX. Para isso, foi estabelecido um protocolo de transfecção onde obtivemos uma linhagem permanente que expressa a Cav-1 fluorescente, denominada GRX GFP-Cav. Por microscopia óptica, foi observado que as células GRXGFP-Cav apresentam uma morfologia alterada em relação às células GRX. Dados de imunoblotting comprovaram que houve aumento da expressão da Cav-1 nas GRXGFP-Cav. Experimentos de colocalização nas células transfectadas, utilizando o anticorpo para Cav-1 conjugado a um segundo anticorpo que emite fluorescência vermelha, comprovaram o sucesso da transfecção. Uma vez que esta proteína desempenha um importante papel no estado de ativação das HSC, as células transfectadas são uma excelente ferramenta para o estudo da fibrose hepática através da microscopia confocal.

Hepatic fibrosis is among the diseases that cause most deaths in the world, and is characterized by the accumulation of fibrous extracellular matrix, which presence damages the liver functions. The hepatic stellate cells (HSC) actively participate in this process by modifying their quiescent phenotype, featured for presenting lipid-rich cytoplasm, to an activated phenotype in response to liver injury. Hepatic fibrosis can cause liver failure and portal hypertension, leading to modification of hepatic architecture. The GRX cell line is an activated HSC model. Caveolae are small invaginations (50 to 100nm) on the plasma membrane.These structures have a U or vesicles shape, and occur on all cell types. The caveolae are characterized as membrane microdomains or lipid rafts, regions that are especially rich in glycosphingolipids, cholesterol and GPI-anchored proteins. Caveolae play important roles in the physiology of cells such as transcytosis, endocytosis, pinocytosis, cholesterol homeostasis, signal transduction pathways, cell migration, cell cycle control, and cell polarity. The major proteins that make up the family of caveolae are caveolins, the most important being the caveolin-1 (Cav) -1, which along with caveolae, plays important roles in the cell. The Cav-1 is a structural membrane protein that stabilizes membrane present in all cell types, helping to maintain protein residing in caveolae. In cirrhotic livers, it is found an increased expression of CAV-1 in sinusoidal endothelial cells and HSC, suggesting that CAV-1 may be associated with portal hypertension accompanying the process of fibrosis. In the present study, it was established a protocol for inserting a Cav-1 with EGFP-conjugated gene by transfecting a DNA plasmid into GRX cells. Through this technique, we obtained the permanent cell line which express Cav-1 fluorescent called GRXGFP-Cav. By optical microscopy, it was observed that GRXGFP-Cav cells exhibit an altered morphology compared to GRX wild type. Immunoblotting data showed that there was an increased expression of Cav-1 in GRXGFP-Cav. Colocalization analysis in transfected cells, using antibody to CAV-1 conjugated to a second antibody that emits red fluorescence, proved the success of the technique. Since this protein plays an important role in the activation state of HSC, the transfected cells are an excellent tool for the study of liver fibrosis by confocal microscopy.