Estudos com o jaburetox : efeito tóxico de e. coli liofilizadas carregadas com o peptídeo e análise da influência do epitopo v5 na formação de agregados

Abstract

Ureases (E.C. 3.5.1.5) são enzimas níquel dependentes que estão envolvidas na biodisponibilidade de nitrogênio e em mecanismos de defesa contra predadores e patógenos em plantas. Nosso grupo descreveu a atividade inseticida da Canatoxina, uma isoforma da urease de Canavalia ensiformis. Essa toxicidade depende da liberação de um peptídeo interno de 10 kDa, o Pepcanatox, que é liberado pela hidrólise da proteína por enzimas digestivas do tipo-catepsinas dos insetos suscetíveis. Baseado no sequência N-terminal do Pepcanatox, um fragmento de 270 pb correspondente ao pepcanatox foi clonado e expresso em Escherichia coli. Este peptídeo denominado Jaburetox-2Ec, fusionado com um epitopo V5 e seis histidinas na região C-terminal foi testado contra insetos e causou 100% de mortalidade em modelos como Dysdercus peruvianus, e Spodoptera frugiperda após a ingestão de microgramas do peptídeo purificado. A fim de retirar o epitopo V5 da sequência do peptídeo, a sequência de DNA do Jaburetox-2Ec foi reamplificado por PCR, clonado em plasmídeo pET23a obtendo o peptídeo adicionado apenas da cauda de seis histidinas, o Jaburetox-V5. Nesse trabalho foi testada a atividade inseticida de E. coli liofilizadas, carregadas com o Jaburetox-V5, contra insetos modelo que se mostraram suscetíveis ao Jaburetox-2Ec (D. peruvianos e S. frugiperda), bem como contra o Aedes aegypti. Além disso, foi analisado se o epitopo V5 influencia na agregação do peptídeo purificado, pela comparação entre o Jaburetox-2Ec e Jaburetox-V5 por SDS-PAGE a 15% durante 4 semanas, com os peptídeos armazenados em diferentes tampões e em duas temperaturas, 4°C e -20°C. Os resultados demonstraram letalidade do peptídeo acumulado na célula bacteriana liofilizadas apenas contra o mosquito A. aegypti e que há influência do epitopo V5 no processo de agregação dos peptídeos.