Genômica comparativa em Eucalyptus grandis relativa a genes codificados de fatores de transcrição da família Dof

Abstract

O objetivo que norteou o presente trabalho foi identificar as sequências gênicas correspondentes a fatores de transcrição da família Dof em Eucalyptus grandis, e realizar análises das mesmas, incluindo a análise filogenética. A família Dof ("DNA binding with One Finger") compreende fatores de transcrição exclusivos de plantas, caracterizados pela presença de um motivo de ligação ao DNA semelhante a "dedos-de-zinco". As proteínas Dof exercem efeitos ativadores ou repressores da transcrição, atuando sobre promotores de genes associados aos mais diferentes metabolismos vegetais. Inicialmente, foram obtidas as sequências de genes Dof dos vegetais Arabidopsis thaliana, Arabidopsis lyrata, Carica papaya, Populus trichocarpa, Vitis vinifera, Sorghum bicolor, Chlamydomonas reinhardti, Oryza sativa indica e Zea mays, dos bancos de dados online “The Arabidopsis Information resource” (TAIR) e “Plant Transcription Factor Database”. A sequência peptídica correspondente ao domínio Dof de cada um destes genes foi obtida por meio de alinhamentos utilizando a ferramenta online Pfam, do “Sanger Institute”. As sequências peptídicas foram então reversamente traduzidas para nucleotídeos por meio da ferramenta online “Expasy Reverse Translate”, e utilizadas em buscas de BLAST local no genoma de E. grandis gerado pelo projeto GENOLYPTUS. Arcabouços das sequências nucleotídicas Dof de altas identidades foram utilizados em buscas em diferentes bancos de dados online, incluindo aqueles disponíveis no GenBank, no Populus EST Database, no banco de dados do Projeto "Genolyptus: Rede Brasileira de Pesquisa do Genoma de Eucalyptus", e no banco de sequências genômicas de E. grandis "Eucagen", de acesso restrito. As 20 sequências de E. grandis resultantes foram confirmadas por meio de alinhamentos com as demais sequências Dof conhecidas. As 20 sequências Dof obtidas foram traduzidas para aminoácidos e utilizadas em análises filogenéticas, incluindo alinhamentos com o programa MUSCLE. O alinhamento inicial demonstrou a existência de duas sequências idênticas, e uma sequência que não possui o domínio Dof completo. Sendo assim, as análises prosseguiram com 18 sequências Dof. Um novo alinhamento demonstrou que as sequências coincidiam perfeitamente com a descrição dos fatores de transcrição Dof, alinhando-se corretamente apenas no domínio Dof (altamente conservado), e variando consideravelmente fora do domínio Dof. Foram construídas duas árvores filogenéticas pelo método de máxima verossimilhança, incluindo uma árvore contendo apenas as sequências mais recentes disponibilizadas no Eucagen, e outra incluindo as sequências Dof de E. grandis juntamente com as de A. thaliana e P. trichocarpa. Pelas árvores filogenéticas foi demonstrada a proximidade estrutural e possivelmente funcional dos fatores de transcrição Dof destas três espécies, classificando os genes em 10 grandes grupos de ortólogos , e definindo pares de parálogos que incluíram os genes recém-descobertos. Cinqüenta diferentes motivos conservados, além do domínio Dof, foram identificados com o emprego do programa MEME, sendo 31 destes compartilhados pelas três espécies vegetais analisadas. A distribuição de motivos conservados fora do domínio Dof reforçou a localização dos genes nas árvores filogenéticas, demonstrando que os supostos parálogos possuíam motivos em comum. Portanto, foram obtidas 18 sequências completas de proteínas Dof derivadas do transcriptoma e confirmadas no genoma de E. grandis. Estas sequências possuem domínios de alta identidade com a descrição do domínio Dof, indicando suas funcionalidades, e possuem motivos conservados em comum com genes Dof de A. thaliana e P. trichocarpa. Ensaios visando a clonagem, a expressão heteróloga e ensaios de atividades, bem como estudos genéticos e transgênicos serão futuramente conduzidos com vistas a comprovar a função destes genes em E. grandis.