Criação de mutantes por inserção de transposon em arroz como ferramenta de genômica funcional em cereais

Abstract

Com o seqüenciamento do genoma do arroz (Oryza sativa L.), foi estimado que esta planta possui cerca de 40.000 genes, muitos desses de função ainda desconhecida. Um método viável para a determinação da função gênica consiste na produção de mutantes para cada gene, e no estudo dos efeitos dessas mutações na planta. Mutantes podem ser produzidos por inserção de uma "tag" de DNA na sequência do gene, causando a interrupção da função deste e gerando um fenótipo mutante em potencial. O sistema de transposon de dois componentes iAc/Ds é vantajoso por ser capaz de mobilizar a inserção mutagênica para produzir novas inserções. Aplicamos esse sistema de transposon (inicialmente inserido com o T-DNA) para gerar bibliotecas de mutantes por inserção de T-DNA e/ou transposon. Nesse sistema a transposição do elemento Ds é desencadeada em calos em cultura por uma expressão transiente da transposase depois de co-cultivo com Agrobacterium portando uma construção iAc. Essa construção contém gfp como repórter visual e permite a seleção de regenerantes estáveis cujo transposon tenha sido mobilizado (GFP-, Ds+). Usando esse sistema, produzimos inúmeras linhagens de calos transgênicos que contêm o elemento Ds/T-DNA e, a partir dessas, linhagens com o elemento Ds mobilizado da inserção original (launch pad). Até o momento tivemos sucesso em regenerar até a fase de planta adulta quatro linhagens. As seqüências flanqueadoras de cada inserção desta primeira geração de linhagens transgênicas estão sendo recuperadas e seqüenciadas a fim de se identificar o local da inserção no genoma do arroz e caracterizar possíveis genes nocauteados.