Desenvolvimento de aparatos de expressão in tandem de enzimas da via de síntese de carotenoides em leveduras de interesse industrial

Abstract

Os carotenoides são pigmentos tetraterpenos sintetizados por organismos fotossintéticos e por alguns fungos e bactérias heterotróficos. Nos seres humanos, os carotenoides são obtidos pela dieta e desempenham papéis importantes, como os de antioxidantes, de precursores de provitamina A e de fotoprotetores. Os carotenoides comercialmente relevantes incluem o β-caroteno, o licopeno e a zeaxantina, dentre outros. Por sua vez, o desenvolvimento de biologia sintética e engenharia metabólica possibilitou a síntese microbiana de carotenoides, por exemplo, utilizando microrganismos para obter metabólitos provenientes da introdução de genes carotenogênicos heterólogos. Apesar de Saccharomyces cerevisiae não acumular naturalmente carotenoides, exemplos bem-sucedidos descritos na literatura a definem como um modelo potencial para produção de carotenoides. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi desenvolver linhagens de S. cerevisiae com aparatos de expressão de sequências codificadoras de enzimas da via de síntese de carotenoides. Para isso, foram obtidas as sequências codificadoras dos genes CrtE, CrtI e CrtYB de Xanthophyllomyces dendrorhous e HMG1 de S. cerevisiae, que codificam enzimas essenciais para a geração de precursores para a biossíntese de carotenoides. Por fim, foi obtida a sequência curta intergênica IGG6 de Glarea lozoyensis, que possibilita o reinício da tradução proteica em mRNA derivado de genes policistrônicos, favorecendo a formação de múltiplas proteínas de forma similar àquela observada para operons procariotos. Uma vez obtidas as sequências, procedeu-se com a construção do dispositivo de expressão policistrônico denominado BetaCar_PC_yeast. Os resultados obtidos demonstram a confirmação por eletroforese da amplificação da concatenação do construto contendo os fragmentos CrtE-HMG1-CrtIA, bem como do construto contendo os fragmentos CrtIB-CrtYB. Por conseguinte, as perspectivas futuras direcionam para a concatenação de ambos os construtos gerados, para geração do construto final CrtE-HMG1-CrtIA-CrtIB-CrtYB. Depois, pretende-se efetuar a clonagem em vetor de expressão, gerando linhagens de S. cerevisiae com múltiplas cópias dos aparatos de expressão policistrônicos.

Carotenoids are tetraterpene pigments synthesized by photosynthetic organisms, heterotrophic fungi, and bacteria. In humans, carotenoids are obtained from the diet and play important roles as antioxidants, pro-vitamin A, and photoprotectants. Commercially relevant carotenoids include β-carotene, lycopene, and zeaxanthin. In turn, the development of synthetic biology and metabolic engineering has enabled the microbial synthesis of carotenoids, for example, by using microorganisms to obtain secondary metabolites from the introduction of heterologous carotenogenic genes. Although Saccharomyces cerevisiae does not naturally accumulate carotenoids, it has been shown to be a potential microbial host based on successful examples in the literature as a model for carotenoid production. The aim of this study was to develop Saccharomyces cerevisiae strains using an expression apparatus for coding sequences for enzymes in the carotenoid synthesis pathway. To do this, we obtained the coding sequences of CrtE, CrtI, and CrtYB from Xanthophyllomyces dendrorhous and HMG1 from S. cerevisiae, which encode enzymes essential for the generation of precursors for carotenoid biosynthesis. Finally, we obtained the short intergenic sequence IGG6 from Glarea lozoyensis, which enabled the restart of protein translation in mRNA derived from polycistronic genes, favoring the formation of multiple proteins in a manner similar to that observed for prokaryotic operons. Once the sequences of the DNA parts were obtained, a polycistronic expression device called "BetaCar_PC_yeast'' was constructed. The results obtained were confirmed by electrophoresis of the amplified construct containing the CrtE-HMG1-CrtIA fragments, and the construct containing the CrtIB-CrtYB fragments. Future proposed works include the concatenation of both constructs generated, resulting in the final CrtE-HMG1-CrtIA-CrtIB-CrtYB construct.