Clonagem de dois genes de quitina sintase de Magnaporthe oryzae em vetor para a transformação de arroz

Abstract

O arroz (Oryza sativa) é uma planta de grande importância alimentar sendo o alimento básico da dieta de mais da metade da população mundial. O fungo Magnaporthe oryzae é o patógeno responsável pela doença brusone do arroz que causa graves prejuízos a cultura dessa planta. A quitina é um dos principais polissacarídeos constituintes da parede celular dos fungos e é muito importante para a sua viabilidade. A quitina sintase é a enzima que polimeriza esse polissacarídeo e existem até sete classes dessa proteína em fungos. O presente trabalho buscou a construção de um vetor para a transformação de arroz que produza moléculas de dupla fita de RNA (dsRNA) correspondentes à parte da seqüência do produto de dois genes da quitina sintase de M. oryzae com o objetivo de tornar a planta resistente a esse fungo ao desencadear o processo de interferência por RNA (RNAi). Como alvos para o silenciamento gênico por RNAi foram utilizados os genes das quitinas sintases de classe I e III. Para a obtenção dos fragmentos dos genes da quitina sintase e para a construção do vetor foram delineados oligonucleotídeos para a amplificação de parte desses dois genes. Com o objetivo de ordenar os dois fragmentos em tandem foi utilizada uma região de seqüência comum entre os genes para a delineação do oligonucleotídeo reverse de um gene e Foward do outro. O RNA total do fungo foi extraído e posteriormente foi sintetizado o cDNA utilizando o oligonucleotídeo T25V. Os fragmentos foram então amplificados utilizando os oligonucleotídeos específicos de cada gene. Os produtos dessa reação foram utilizados juntos em uma nova reação de PCR para a formação da seqüência em tandem. Esse fragmento foi então inserido no vetor pENTR-D/TOPO e posteriormente recombinado no pANDA que é especifico para a produção de moléculas de dsRNA.