Clonagem, expressão e purificação de elF2 beta humano e produção de soro policlonal anti-elF2 beta

Abstract

A síntese protéica é um processo essencial à célula e envolve centenas de macromoléculas. A ausência ou a perturbação da função de qualquer um dos componentes no sistema de tradução podem causar danos à integridade e funcionamento celular. O fator eucariótico 2 de iniciação da tradução (elF2) apresenta um papel-chave no processo de tradução do mRNA e na sua regulação, promovendo a ligação do Met-tRNAi à subunidade ribossomal 40S, em um processo dependente de GTP, e fazendo a seleção do códon AUG no mRNA para início de tradução. O elF2 é um heterotrímero formado pelas subunidades alfa, beta e gama. Na porção amino-terminal da subunidade beta, existe um domínio bastante marcante composto por três blocos de seis a oito resíduos de lisina altamente conservados evolutivamente, que são responsáveis pela ligação de elF2 ao mRNA e a outros dois fatores de iniciação, elF5 e elF2B. Dados não publicados de Laurino JP mostram, em ensaio de curva de crescimento de S. cerevisiae, que o gene desprovido dos blocos de lisina competindo com o gene selvagem, sob controle do mesmo promotor, é capaz de induzir parada do crescimento celular. A partir disso, vem-se sugerindo a forma truncada do gene de elF2 beta humano como um candidato à terapia gênica direcionada principalmente ao tratamento de tumores. Atualmente, o potencial de inibição da síntese protéica através da expressão de elF2 beta truncado está sendo avaliado em nosso laboratório, com experimentos realizados em células de mamíferos em cultivo. Através de uma análise de expressão gênica nessas células será possível correlacionar a presença celular de elF2 beta truncado com o fenômeno de parada do crescimento celular. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma ferramenta imunológica para detecção por “Western-Blot” da expressão das formas selvagem e truncada de elF2 beta. Para isso, a região codificadora (CDS) de elF2 beta humano foi clonada em vetores de expressão em procariotos, a proteína recombinante foi produzida em E. coli, purificada e utilizada na imunização de um coelho Nova Zelândia, que produziu um soro policlonal anti-elF2 beta recombinante. Tal soro foi avaliado quanto ao seu potencial para a detecção da expressão de elF2 beta em extratos de células de mamíferos.

Protein synthesis is an essential process to the cell, involving hundreds of macromolecules. The absence or alteration of any components in translation system may affect the integrity of cell biology. Eukaryotic initiation factor 2 (elF2) plays a key role in the process of mRNA translation and in its regulation, promoting the binding of Met-tRNAi to the 40S ribosomal subunit, in a GTP-dependent mechanism and selecting AUG codon in mRNA to translation initiation. The elF2 is a heterotrimer formed by three subunits termed alpha, beta and gama. In the amino-terminal region of elF2 beta, there are three lysine-rich segments containing six to eight evolutionarily-conserved lysine residues, which are responsible for the binding of elF2 on mRNA, and to another two initiation factors: elF5 and elF2B. In a S. cerevisiae growth curve assay, previous studies have shown that elF2 beta deleted in the lysine-rich segments competing against wild type elF2 beta gene, under the control of the same promoter, was able to stop cell growth (Laurino JP, unpublished data). Considering this finding, we suggest that truncated elF2 beta, lacking lysine-rich segments, could be exploited as a candidate in directed gene therapy, mainly oriented for tumor treatment. Nowadays, in our lab, the protein synthesis blockage through truncated elF2 beta expression is being evaluated in mammalian cell culture assays. A gene expression analysis of these cells will be useful to correlate the cellular presence of truncated elF2 beta with cellular growth arrest phenomenon. The objective of this work was to develop an immunological tool to detect, by Western-Blot, the gene expression of the truncated and wild type elF2 beta. To do this, the coding region (CDS) of human elF2 beta was cloned into prokaryotic cell expression vectors, the recombinant protein was produced in E. coli, purified and used to immunize a New Zeland rabbit, which produced policlonal sera against recombinant elF2 beta. The elF2 beta detection potential of such sera was evaluated in mammalian cell culture extracts.