Padronização de um protocolo de extração de DNA a partir de sangue impregnado em papel filtro para uso na triagem neonatal de doenças lisossômicas selecionadas

Abstract

A Triagem Neonatal consiste no rastreamento neonatal de crianças portadoras de doenças que devem ser diagnosticadas e tratadas o mais precocemente possível a fim de evitar sequelas para o paciente. No Brasil, o Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN) inclui o exame Teste do Pezinho (TP), onde gotas de sangue são impregnadas em papel filtro (SIPF). As doenças lisossômicas de depósito (DLD) são um grupo de doenças onde há acúmulo progressivo de substâncias não metabolizadas, no interior do lisossomo, principalmente devido a uma deficiência enzimática. Os pacientes geralmente são assintomáticos ao nascimento, mas apresentam progressão rápida da doença e manifestações irreversíveis. Atualmente, nenhuma DLD faz parte do TP disponibilizado pelo SUS, de maneira que a inclusão dessas doenças no TP terá um ganho significativo na qualidade de vida futura dos recém-nascidos. A triagem é composta por um conjunto de exames realizados na amostra de SIPF, dentre eles diferentes testes bioquímicos. Além disso, o SIPF pode ser utilizado para a extração de DNA e então para a aplicação em diversas técnicas moleculares. O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Molecular do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre. O objetivo do trabalho foi padronizar um protocolo de extração orgânica de DNA de SIPF utilizando uma quantidade mínima de amostra, 3 discos de 3-mm, para ser utilizado, principalmente, no Sequenciamento de Nova Geração (NGS). O estabelecimento de um protocolo de extração padronizado possibilita que o SIPF enviado ao Serviço de Genética Médica para testes enzimáticos seja reaproveitado na análise molecular, reduzindo significativamente o tempo de confirmação diagnóstica. A padronização do protocolo foi realizada utilizando vinte amostras controle, quantificadas após a extração de DNA, e analisadas através das técnicas de PCR, PCR-RFLP e Sequenciamento de Sanger. Uma vez estabelecida a padronização do método, foram analisadas através de NGS, três amostras de SIPF de pacientes com diagnóstico bioquímico prévio pertencentes a um projeto piloto de triagem neonatal para DLDs selecionadas, para testar a aplicabilidade clínica do protocolo padronizado e assim confirmar o diagnóstico bioquímico inicial através do diagnóstico molecular. Os resultados demonstram eficiência na padronização do protocolo de extração orgânica, possibilitando o desenvolvimento das diversas técnicas moleculares propostas: PCR, PCR-RFLP, Sequenciamento de Sanger e Sequenciamento de Nova Geração (NGS). Foi possível determinar o genótipo das três amostras encaminhadas pelo projeto piloto de triagem neonatal, confirmando a aplicabilidade clínica da padronização do protocolo de extração orgânica de DNA de SIPF, utilizando apenas 3 discos de 3-mm.

Dried blood spot (DBS) samples have been used for diagnostic purposes since its introduction for the neonatal screening of phenylketonuria almost 50 years ago. From that time onwards, the range of its applications has been extended until today, including nextgeneration sequencing (NGS) for molecular genetics diagnosis. This study aimed to evaluate a standardized organic method to extract DNA from DBS samples, for its use in the diagnostic setting. The clinical applicability of the method was tested using three samples collected in a newborn screening project for lysosomal storage diseases, allowing the determination of the genotype of the individuals. DNA was extracted from three 3-mm diameter DBS punches. Quality, purity, and concentration were determined, and its performance was assessed through standard PCR, Restriction Length Polymorphism, Sanger sequencing, and Targeted Next-generation sequencing (TNGS). Results were compared with the ones obtained with DNA samples extracted following the internally validated in-house extraction protocol that used six 3-mm punches of DBS and samples extracted from whole blood. This organic method proved to be effective in obtaining high-quality DNA from DBS, being compatible with several downstream molecular applications, in addition to presenting a lower cost per sample.