Desenvolvimento de ferramentas para a construção e análise de mutantes funcionais no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae

Abstract

O gênero Metarhizium é composto por fungos entomopatogênicos de elevada importância, como Metarhizium anisopliae, e são extensivamente utilizados para o controle de artrópodes praga como Helicoverpa armigera e Spodoptera frugiperda, ambas pragas de diversas culturas como milho, soja e algodão há mais de cem anos. Atualmente, esporos de Metarhizium spp. compõe mais de um terço de todas formulações fúngicas comerciais para o controle biológico. Ainda assim, estas formulações carecem de eficiência quando comparadas ao controle químico. Para mudar este cenário, diversas abordagens estão sendo empregadas, como o estudo de determinantes de virulência e a engenharia genética para a obtenção de linhagens melhoradas para o controle biológico. No entanto, a escassez de ferramentas moleculares padronizadas aplicáveis aos fungos utilizados em controle biológico atrasa o desenvolvimento de linhagens competitivas, e dificulta o estudo do impacto, disseminação e evolução que esses organismos terão na natureza. A fim de ampliar o repertório de ferramentas moleculares para se trabalhar com M. anisopliae, foi construído, no presente trabalho, um cassette para a expressão do sistema repórter Katushka, uma proteína fluorescente far-red de alto brilho, sob o controle do promotor forte gpdA e terminador TrpC de Aspergillus nidulans, o qual foi transformado em M. anisopliae. Katushka é conhecido por ser um sistema eficiente de gene-reporter para técnicas de imageamento in vivo, e ainda não havia sido padronizada para M. anisopliae. Essa construção demonstrou ser geneticamente estável e sua fluorescência pôde ser detectada em besouros adultos de Ulomoides dermestoides após o ciclo completo de infecção de M. anisopliae expressando Katushka. Ainda, a expressão de Katushka em M. anisopliae não influenciou na sua virulência em um bioensaio com larvas de Tenebrio molitor, característica importante para que um gene-reporter possa ser usado em diversos estudos que enfoquem o processo de infecção. A escassez de promotores endógenos descritos em M. anisopliae limita as opções para as análises em nível molecular. Assim, Katushka foi usada como repórter para o screening de sequências promotoras de diferentes tamanhos encontradas à montante dos genes β-tubulina, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdMa), gamma-actina e trp1 de M. anisopliae. As construções de 1.000 pb e 500 pb da β-tubulina foram capazes de produzir níveis de fluorescência similares quando comparadas ao promotor padrão PgpdA. As construções de PgpdMa não se mostraram eficientes. Não foram obtidos mutantes para as construções dos promotores da gamma-actina e trp1 nos screenings realizados. Pesquisas adicionais são necessárias para aferir estatisticamente a eficiência desses promotores, bem como os elementos genéticos presentes em suas sequências. Este trabalho resultou na construção de modelos eficientes para estudos moleculares em M. anisopliae.

The Metarhizium genus is composed by important entomopathogenic fungi species, such as Metarhizium anisopliae, and have been extensively used for controlling arthropod pests such as Helicoverpa armigera and Spodoptera frugiperda, both pests of maize, soy and cotton farms, among others, during the last Century. To date, more than a third of all commercially available fungal formulations for biological control are composed by Metarhizium spp. spores. Still, these formulations lack the effectiveness of chemical control. To change this scenario, many approaches have been made, such as the study of virulence determinants and genetic engineering to achieve enhanced strains for biological control. However, the lack of standardized molecular tools applicable to fungi species used for biological control slows the development of competitive strains, and difficult the study of the impact, dissemination and evolution that the released transgenic organisms can have on nature. In order to increase the repertoire of molecular tools available to work with M. anisopliae, in this work, a cassette for the expression of the reporter system Katushka, a bright far-red fluorescent protein, under the control of the strong gpdA promoter and TrpC terminator from Aspergillus nidulans was constructed and transformed in M. anisopliae. Katushka is known as an efficient gene-reporter system for in vivo imaging techniques, and have not been standardized in M. anisopliae. This construction was shown to be genetically stable and its fluorescence detectable in Ulomoides dermestoides adult beetles after the whole infection cycle of M. anisopliae strains expressing Katushka. Moreover, Katushka expression did not influenced M. anisopliae virulence in a Tenebrio molitor bioassay, which is an important characteristic for a gene-reporter to be used on a variety of studies that focus on the infection process. The lack of endogenous promoters described in M. anisopliae limits the options for molecular scale analysis. As such, Katushka was used as a reporter for the screening of different sized endogenous promoter sequences found upstream of β-tubulin, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (gpdMa), gamma-actin and trp1 genes from M. anisopliae. The 1000 bp and 500 bp β-tubulin promoter constructions were able to produce fluorescence levels similar when compared to the standard promoter PgpdA. The PgpdMa constructions were not efficient. Mutants could not be obtained for gamma-actin and trp1 promoter constructions in the screenings performed. More research is needed to statistically infer promoter efficiency, as well as the genetic elements present in the sequences. This work resulted in the construction of efficient models for molecular studies in M. anisopliae.