Influência da pneumonia experimental aguda e crônica por Pseudomonas aeruginosa nas concentrações livres de tobramicina no fluido de revestimento epitelial pulmonar

Abstract

Introdução: Infecções pulmonares causadas por Pseudomonas aeruginosa formadoras de biofilmes são resistentes ao tratamento devido à dificuldade de penetração dos antimicrobianos. Previamente demonstramos que a infecção aguda e crônica reduz a penetração pulmonar do aminoglicosídeo tobramicina (TOB) em cerca de 70%, indicando que a presença de infecção/inflamação, e não a cronicidade desta, leva à diminuição da exposição tecidual ao fármaco. Como as infecções pulmonares iniciam pela contaminação do fluido de revestimento epitelial pulmonar (PELF), é importante conhecer as concentrações brônquicas livres de antimicrobianos nesse local para a escolha de posologias que garantam a erradicação microbiana. O objetivo deste trabalho foi avaliar a penetração brônquica da TOB em modelo experimental de infecção aguda e crônica por P. aeruginosa utilizando a técnica de microdiálise. Metodologia: Todos os experimentos foram aprovados pelo CEUA/UFRGS (#32345). Para o desenvolvimento da infecção aguda, ratos Wistar machos (45 d) anestesiados (cetamina/xilazina, 100:10 mg/kg, i.p.), foram inoculados pela via i.t. com 109 UFC/mL da cepa não-mucoide PA14 (n = 6). Para produzir a infecção crônica, 107 UFC/mL de P. aeruginosa mucoide ATCC 27853 foi imobilizada em beads de alginato, que foram inoculados da mesma forma em animais de mesma idade (n = 3). Sete e quatorze dias após a inoculação, respectivamente, os animais foram anestesiados (uretano, 1,25 mg/kg, i.p.) e receberam TOB 10 mg/kg via i.v. bolus. Animais hígidos de mesma idade foram utilizados como controle (n = 7), assim como animais inoculados com bead branco de alginato, sem a bactéria (n = 4). As concentrações livres brônquicas de TOB foram coletadas por microdiálise, utilizando a sonda CMA 20® (2 mm, custom made), a cada 30 min por 12 h pós-dose e quantificadas por CLAE-EM/EM utilizando método validado. Para a comparação com os grupos contendo beads de alginato, foi desenvolvido um bead de agarose, que apresentou tamanho e dispersão adequados. Os beads brancos de agarose foram inoculados a animais hígidos e a farmacocinética pulmonar da TOB foi determinada por microdiálise utilizando a sonda CMA 20® (4 mm). Os parâmetros farmacocinéticos foram determinados por abordagem não-compartimental (Phoenix®) e a comparação estatística feita por ANOVA (= 0,05) seguida de Teste de Bonferroni. Resultados: Os resultados demonstraram que não há alteração na meia-vida de eliminação da TOB no PELF (aprox. 4,5 h) em animais hígidos, com infecção aguda e crônica e inoculados com beads brancos, sendo que essa se mostrou semelhante à meia-vida pulmonar obtida anteriormente nas mesmas condições. A infecção aguda reduziu a exposição da TOB no PELF em torno de 70% em relação aos animais hígidos. A infecção crônica alterou o equilíbrio pulmão/PELF da TOB pela redução da exposição plasmática devido ao aumento do clearance total. O grupo inoculado com bead branco de agarose não apresentou a mesma redução da exposição pulmonar observada no grupo inoculado com bead branco de alginato. Conclusões: Infecções agudas reduzem a exposição brônquica à TOB, semelhante ao observado para a exposição pulmonar. A infecção crônica alterou a farmacocinética da TOB, reduzindo as concentrações plasmáticas e pulmonares e aumentando a penetração brônquica devido à lesão tecidual e ao aumento da permeabilidade vascular. Os resultados indicaram que as alterações encontradas no grupo de infecção crônica foram principalmente devidas aos efeitos da infecção/inflamação, associados à presença do alginato, componente do biofilme mucoide da P. aeruginosa e dos beads de alginato utilizados para inoculação.

Introduction: Pulmonary infections caused by biofilm-forming Pseudomonas aeruginosa are resistant to treatment due to the difficulty of antimicrobial penetration. It has been previously demonstrated by our group that acute and chronic infection reduces tobramycin (TOB) lung penetration in about 70% due to the presence of infection/inflammation rather than the infection chronicity. Because lung infections initiated by contamination of the pulmonary epithelial lining fluid (PELF), it is important to determine antimicrobials free concentration at this biophase to better determine doses to ensure microbial eradication. The aim of this study was to evaluate the bronchial penetration of TOB in experimental model of acute and chronic P. aeruginosa lung infection, using microdialysis. Methodology: Studies approved by CEUA/UFRGS (# 32345, appendix). For the development of acute infection, Wistar rats (45 d) were anesthetized (ketamine/xylazine, 100:10 mg/kg, i.p.) and inoculated i.t. with 109 CFU/mL of P. aeruginosa non-mucoid PA14 strain (n = 6). To produce chronic infection, 107 CFU/mL P. aeruginosa mucoid ATCC 27853 strain was immobilized in alginate beads, which were inoculated in the same way in animals of the same age (n = 3). Seven and four days after inoculation, respectively, the animals were anesthetized (urethane, 1.25 mg/kg, i.p.) and received TOB 10 mg/kg i.v. bolus. Healthy animals of the same age were used as a control group (n = 7). Another groups was inoculated with blank alginate beads, without bacteria (n = 4). Free TOB bronchial concentrations were harvested by microdialysis using a custom made 2 mm CMA 20® probe every 30 min up to 12 h post-dose and the drug quantified by a validated HPLC-MS/MS method. To determine the influence of the alginate beads on TOB pharmacokinetics, an agarose bead was developed, which exhibited proper size and dispersion. The blank agarose beads were inoculated in the animals and TOB pharmacokinetics was determined in animal‟s lung interstitial fluid. Free lung TOB‟s concentrations were determined using a 4 mm CMA 20® probe. Pharmacokinetic parameters were determined by non-compartmental approach (Phoenix®) and a statistical comparison performed by ANOVA ( = 0.05) followed by Bonferroni test. Results: There was no change in TOB half-life (about. 4.5 h) in PELF in acute and chronic infected animals and in those inoculated with alginate and agarose blank beads. The half-lives determined were similar to those reported previously in lung interstitial fluid in the same experimental conditions. Acute infection reduces PELF exposure to TOB by 70% compared to healthy animals. Chronic infection altered the lung/PELF balance by reducing plasma exposure due to increased clearance. The group inoculated with blank agarose beads did not show the same reduction in lung exposure observed in the group inoculated with blank alginate beads. Conclusions: Acute infections reduce bronchial exposure to TOB, similar to that observed for pulmonary exposure. Chronic infection altered the pharmacokinetics of TOB, reducing plasma and pulmonary concentrations and increasing bronchial penetration due to tissue damage and increased vascular permeability. The results indicated that the changes found in chronically infection group were mainly due to the effects of infection/inflammation associated with the presence of alginate, which is a component of the mucoid biofilm, and also of the beads used for P. aeruginosa inoculation.