Estudo das vias envolvidas na síntese de nucleotídeos em Echinococcus spp. (Platyhelminthes, Cestoda) para a identificação de novos alvos para o controle parasitário

Abstract

Echinococcus granulosus sensu lato (s.l.) é um complexo de espécies crípticas, cujas formas larvais (cisto hidáticos ou metacestódeos) são causadoras de equinococose cística, uma zoonose crônica de distribuição mundial e endêmica no Cone sul da América do Sul, que traz prejuízos para a pecuária e para a saúde pública. No interior do cisto se desenvolvem os protoescólices, formas pré-adultas e infectivas para o hospedeiro definitivo. Devido à baixa eficiência dos tratamentos atuais, o desenvolvimento de novos anti-helmínticos se faz necessário. Análises in silico dos genomas de cestódeos listaram enzimas da via de salvação de nucleotídeos incluindo a ribonucleotídeo-redutase (RNR, como alvos para o desenvolvimento de anti-helmínticos. A RNR é um tetrâmero composto por duas subunidades RNR1 e duas subunidades RNR2. O presente trabalho buscou inicialmente avaliar as vias de síntese de nucleotídeos como potenciais alvos para o desenvolvimento de fármacos anti-helmínticos. Através de uma análise in silico utilizando as sequências das proteínas de ser humano foram identificados ortólogos das enzimas da via de salvação em E. granulosus s.s., com base nesses dados foram escolhidos genes para terem sua expressão analisada. Protoescólices foram cultivados na presença dos inibidores de RNR como a hidroxiureia (HU)( inibidor comercial) e COH29 (inibidor experimental) sendo observada a morte de alguns protoescólices 24 h e 72 h após o tratamento , também foram observadas diferenças entre a mortalidade observada em E. granulosus s. s. e em Echinococcus ortleppi, E. orteppi sendo mais resistente ao tratamento. Protoescólices tratados com HU foram utilizados para a análise da expressão dos genes codificadores de hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferase, de nucleosídeodifosfato-quinase, de UMP-CMP-quinase e de CTP-sintase por qPCR. Foi observada alteração na expressão desses genes, no entanto são necessárias mais réplicas do experimento para sua validação, também foram iniciados testes para a escolha de outro gene normalizador. Além disso foram identificados in silico os genes codificadores das duas subunidades da RNR denominadas EgRNR1 e EgRNR2 sugerindo que a enzima ativa também é um tetrâmero nesta espécie. A expressão heteróloga e purificação da EgRNR2 já foi realizada por nosso grupo de pesquisa. Aqui, foi realizada a clonagem da sequência codificadora da EgRNR1 e a subunidade recombinante (rEgRNR1) foi expressa em Escherichia coli. A rEgRNR1 mostrou-se insolúvel, o que demandou a padronização das condições de expressão e purificação. Não foi possível obter a rEgRNR1 solúvel, mas sua presença no sobrenadante foi confirmada por imunoblot, em pequena quantidade sendo necessárias novas abordagens para a solubilização da rEgRNR1.

Echinococcus granulosus sensu lato is a group of cryptic species whose larval stage (hydatid cyst or metacestode) cause cystic echinococcosis, a chronic zoonosis of global distribution and endemic in the Southern Cone responsible for losses to livestock and human health. Inside the cyst the protoscoleces, the pre-adult stage and infective to the definite host, are generated. Due to the low efficiency of the current treatments is necessary to develop new anthelminthic and new therapeutical strategies. In silico analyses listed some enzymes of the nucleotide salvage pathway including the ribonucleotide-reductase (RNR) as potential targets. The active RNR is a tetramer formed by two RNR1 subunits and two RNR2 subunits. The present study evaluated the nucleotide synthesis pathway as potential targets for anthelminthic development. In silico analysis using human protein sequences was used to identify. orthologs of the nucleotide salvage pathway in Echinococcus granulosus s. s., with this data some genes were chosen for having their expression analyzed. Protoscoleces were cultivated in the presence of RNR inhibitors hydroxyurea (a commercial inhibitor) and COH29 (an experimental inhibitor) and loss of viability was observed 24 h and 72 h after treatment, different in mortality were also observed between E. granulosus s. s. and Echinococcus ortleppi, E. orteppi being more resistente to the treatment. The protoscoleces were cultivated in the presence of hydroxyurea were utilized to analyze the expression of hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase and nucleoside diphosphate kinase, and UMP CMP kinase and CTP synthase coding genes. Changes in the expressions of these genes were observed, but it’s necessary to replicate the experiment to validate it. In addition, the selection of a new normalization gene was initiated. The RNR subunits coding genes were identified, named EgRNR1 and EgRNR2, suggesting it’s also a tetramer in this species. The heterologous expression and purification of EgRNR2 has already been done by our research group. Here, the cloning of the EgRNR1 coding sequence and the recombinant subunit was expressed in Escherichia coli, however the rEgRNR1 was insoluble so standardization of expression and purification conditions were tested. It wasn’t possible to obtain the soluble EgRNR1, but the presence of the subunit in the supernatant was confirmed by immunoblot, but in low concentration being necessary to try new approaches to rEgRNR1 solubilization.