Análise de neurônios gabaérgicos parvalbumina-positivos em áreas sensoriais no modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao ácido valproico

Abstract

O Transtorno do Espectro Autista é uma desordem do neurodesenvolvimento caracterizada, segundo o DSM-V, por uma díade comportamental: déficits de comunicação e interação social além de comportamentos repetitivos ou estereotipados. Outro aspecto de extrema importância para o transtorno são as alterações sensoriais presentes em mais de 90% dos indivíduos, tais como hiperresponsividades a estímulos não nocivos (visuais, táteis, auditivos) e hiporresponsividade a estímulos nocivos, que implicam em prejuízo na qualidade de vida. Apesar da etiologia do autismo não ser conhecida, tanto fatores genéticos quanto ambientais já foram associados à desordem, incluindo a utilização de ácido valproico (VPA) durante a gestação – situação que aumenta significativamente a chance do desenvolvimento de autismo nos filhos. Baseado nessas observações, desenvolveu-se um modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao VPA, validado pela identificação de diversas características (comportamentais, morfológicas e moleculares) do tipo autista. No presente trabalho, realizou-se uma análise quantitativa e organizacional de interneurônios GABAérgicos positivos para parvalbumina em regiões associadas com processamento sensorial – Área Somatossensorial Primária (ASSP) e Região da Amígdala (RAM). A obtenção dos animais passou por um processo inicial de acasalamentos, onde a verificação da fecundação foi comprovada através da identificação de espermatozoides no líquido vaginal na manhã posterior ao pareamento. As fêmeas do grupo VPA foram induzidas com uma injeção intraperitoneal de VPA (600mg/kg) no E12,5. Filhotes machos com 30 dias foram anestesiados e perfundidos com paraformaldeído 4% para promover a fixação tecidual, após a eutanásia relizou-se a remoção do encéfalo, posteriormente preservado em Tissue-Tek® a -80ºC. O tecido foi cortado em criostato e as fatias contendo as estruturas de interesse foram identificadas através do atlas Paxinos. Realizou-se imunofluorescência com objetivo de obter três marcações: DAPI, NeuN e Parvalbumina (PV). As imagens foram obtidas por microscopia confocal e processadas no software ImageJ com o plug—in Cell Counter. A análise estatística foi realizada no software Graph Pad Prims 5, utilizando o Teste t de Student seguido de correção de Welch, considerando p<0,05 como significativo. Na ASSP o grupo VPA exibiu, além de severa desorganização laminar, redução significativa na quantidade de células não-neuronais na camada IV-V (1,26x), demonstrando um prejuízo em células gliais, essenciais para a manutenção da homeostase local, além disso, a quantidade e a densidade de neurônios PVpositivos também demonstraram redução significativa na camada IV-V (3,06x), enquanto na camada II-III (1,69x) houve um aumento significativo. Complementarmente, a análise de todas as camadas em conjunto não apresentou diferenças significativas para nesses parâmetros, demonstrando uma possível alteração na migração desses interneurônios entre as camadas corticais. Na Região da Amígdala, houve redução significativa do número e densidade de interneurônios PV+ no grupo VPA (2,66x) Considerando os dados apresentados, nós demonstramos pela primeira vez que a exposição pré-natal ao VPA induziu importantes alterações nas camadas corticais da ASSP e na RAM no que se refere a células não neuronais e neurônios inibitórios PV+. Esses prejuízos no componente inibitório provavelmente resultam em expressivas consequências no balanço excitatório/inibitório que poderiam explicar diversas alterações comportamentais identificadas.

Autism Spectrum Disorder is a neurodevelopmental disorder characterized, according to DSM-5, by a behavioral dyad: impairments in communication and social interaction in addition to repetitive or stereotyped behaviors. Another extremely important aspect for ASD are the sensory alterations present in more than 90% of the individuals with ASD like hyper-responsiveness to non-harmful stimuli (visual, tactile and auditory) and hypo-responsiveness to harmful stimuli, which implies a great loss in life quality. Although etiology is not known, both genetic and environmental factors have been associated with the disorder, including the use of valproic acid during pregnancy – situation that significantly increases the chances of autism development in the children. Based on these observations, an animal model of autism by prenatal exposure to valproic was developed and validated by the findings (behavioral, molecular and morphological) of several autistic-like characteristics. In the present study, a quantitative and organizational analysis of parvalbumin-positive GABAergic interneurons was carried out in sensory processing related regions – Primary Somatosensory Area and Amygdala Region. Obtaining the animals underwent an initial process of mating, in which the fecundation check was confirmed by the presence of spermatozoa in vaginal smear in the morning after pairing. The female were separated and the VPA group received a intraperitoneal injection of VPA (600m/kg) in E12.5. The 30 days old male pups were anesthetized and transcardiacally perfused with paraformaldehyde 4% to promote tissue fixation, after euthanasia the brain was removed and preserved in Tissue-Tek® at -80ºC. The tissue was sliced in cryostat at -20ºC and the slices containing the structures of interest were identified through Paxinos atlas. Immunofluorescence was made in order to identify three markers: DAPI, NeuN and Parvalbumin (PV). The images were obtained by confocal microscopy and processed in ImageJ software with Cell Counter plug-in. Statistical analysis realized in Graph Pad Prism 5 software, using Student's T test followed by Welch's Correction and considering p<0.05 as significant. In Primary Somatosensory Area, VPA group exhibited, besides severe laminar disorganization, significant reduction in non-neuronal cells in layer IV-V (1,26x), demonstrating impairment in glial cells, essential for maintaining local homeostasis, moreover, the quantity and density of PV-positive neurons also showed significant reduction in layer IV-V (3,06x), while in layer II-III (1,69x) was a significant increase. In addition to this, the analysis of all layers together didn't exhibited significant differences for PV+ quantity and density, demonstrating a possible alteration in the migration of these interneurons between the cortical layers. In Amygdala Region, the number and density of PV+ interneurons were significant reduced (2,66x) in VPA group. Considering the present data we demonstrated for the first time that prenatal exposure to VPA induced important alteration in PSSA cortical layers regarding to non-neuronal and inhibitory PV neurons. These impairments in the inhibitory component, probably have expressive consequences in the excitatory/inhibitory balance which may explain some behavioral alteration.