Desenvolvimento e padronização do ensaio de resazurina para avaliar a vitalidade de leveduras no contexto microcervejeiro

Abstract

O crescente número de microcervejarias instaladas no Brasil vem se superando a oferta de insumos para a produção da cerveja, dentre eles, o fermento. Atualmente, existem apenas quatro empresas que comercializam leveduras para a produção de cerveja, sendo apenas duas delas capazes de atender a fábricas com maior produção. Visto isto, para atender a outras regiões, estas empresas transportam o fermento cervejeiro por longas distâncias. Durante este processo, as leveduras acabam sendo expostas a diversas condições, como estresse térmico (devido a falta de refrigeração) e senescência cronológica (devido ao longo tempo de estocagem na empresa e transporte por longas distâncias). Devido a isso, as células chegam ao cervejeiro com baixa capacidade fermentativa devido ao decréscimo de vitalidade e viabilidade. Pensando nisto, este trabalho desenvolveu um teste de vitalidade capaz de estimar o estado fisiológico da levedura baseado no corante resazurina, que é altamente dicromático, apresentando uma mudança colorimétrica proporcional a vitalidade das células altamente detectável a olho nu. Para a padronização do teste, as cepas W34/70 e US-05 foram submetidas a diferentes condições de estresse térmico, e diferentes variáveis, como concentração de resazurina, densidade celular e tempo de incubação do teste foram definidas, usando como comparação o teste de poder de acidificação e avaliando a viabilidade das células pela técnica de azul de metileno. Então, para avaliar a sensibilidade do teste de resazurina, o envelhecimento cronológico de culturas de ambas as cepas foi acompanhado por testes de vitalidade e viabilidade, demonstrando o decréscimo da atividade metabólica e capacidade replicativa das células conforme o aumento do tempo da cultura. Observou-se diferentes taxas de decréscimo da vitalidade e viabilidade entre as cepas. Além disto, foi confirmado o potencial do ensaio de resazurina em prever a capacidade fermentativa de leveduras submetidas a diferentes condições de estresse através de medições de atenuação do mosto, validando a aplicabilidade deste ensaio no contexto microcervejeiro.

The growing of microbrewerys in Brazil has imposing an increase in the production of different supplies for brewing, iincluding yeast biomass for beer fermentation. In Brazil,only four companies produce and sell yeasts for microbreweries, and only two companies are able to attend microbreweries. Additionaly, these companies should be able to deliver yeast cells to different states and cities in Brazil. During transport, the yeast cells are exposed to thermical stress (due to the lack of temperature control) and chronological aging (due to the long period of storage and transport). When delivered to the microbreweries, those yeast cells display problems during beer fermentation as the consequence of a loweryeast vitality and viability and affecting beer’s quality. Thus, in this work a new colorimetric assay was developed to access the vitality of yeast cells by using resazurin. Resazurin is a highly dichromatic dye, showing a colorimetric change proportional to the yeast cellvitality that can be easily visualized by naked eye. To evalute the potential of resazurin to differentiate yeast cells with low and high vitality, different yeast ale and lager strains (US-05 and W34/70, respectively) were submitted to heat shock stress and their vitality was accessed by resazurin, testing different variables as concentration of work solution, cellular density and incubation time. The resazurin data, supported by acidification power test, showed a vitality decrese in cells submited to heat shock stress. Futhermore, the sensibility of the resazurin assay was explored during chronological aging of yeast cells. The assay was capable to detect differences of vitality and viability between yeast strains. In addition, the potencial of the resazurin test to predict the fermentative capacity of stressed and non-estressed yeast cells was observed in wort attenuation assays, comfirming the aplicability of resazurin in the microbrewry context.