Caracterização imunológica e funcional da sinal-peptidase tipo I de Mycoplasma hyopneumoniae

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae é um patógeno suíno economicamente significante que se adere às células do epitélio respiratório causando a pneumonia enzoótica suína (PES). A adesão celular e outros processos importantes para infecção dependem de proteínas de membrana, cuja maioria é transportada pela via de exportação Sec-dependente. A sinal-peptidase tipo I (SPase I) é uma protease de membrana que atua na liberação de proteínas translocadas através da via Sec-dependente. Neste contexto, a SPase I possui participação crítica na exportação de proteínas que podem atuar nas relações patógeno-hospedeiro. O objetivo deste trabalho é caracterizar imunológica e funcionalmente a SPase I de M. hyopneumoniae (MhSPase I) a fim de analisar o seu potencial para o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a PES. Para isso, a sequência de DNA codificadora da MhSPase I, sipS, foi clonada no vetor de expressão pGEX 4T-3 e expressa em Escherichia coli. A MhSPase I recombinante (rMhSPase I) foi purificada e utilizada em ensaios de imunização de camundongos. A rMhSPase I foi altamente imunogênica para camundongos, sendo que sua imunogenicidade foi avaliada por ELISA. A resposta imune celular induzida pela rMhSPase I foi caracterizada através da secreção de citocinas no cultivo de esplenócitos dos camundongos imunizados, sendo estimulados com a proteína recombinante. Este antígeno induziu uma forte resposta celular do tipo Th2, com altos níveis de secreção de interleucina10. Paralelamente, a atividade funcional da rMhSPase I foi analisada através de ensaios de complementação in vivo em E. coli SPase I mutante. A partir deste ensaio, pode-se observar que a MhSPase I é capaz de complementar a atividade de SPase I de E. coli, garantindo a sobrevivência bacteriana, sendo uma proteína essencial para a viabilidade celular. Estes resultados demonstram que a rMhSPase I pode ser um bom alvo para o desenvolvimento de vacinas recombinantes contra a PES, uma vez que é capaz de induzir resposta imune e é fundamental para a sobrevivência bacteriana.

Mycoplasma hyopneumoniae is an economically significant swine pathogen that colonizes the respiratory epithelial cells causing the porcine enzootic pneumonia (PEP). Cell adhesion and other processes important for infection depend on membrane proteins, most of which are transported by the Secdependent pathway. Type I signal-peptidase (SPase I) is a membrane protease which acts in the release of translocated proteins through Sec-dependent pathway. In this context, SPase I is critical for protein export, which may act on pathogen-host relations. The aim of this work is the immunological and functional characterization of M. hyopneumoniae SPase I (MhSPase I), in order to analyze its potential for development of recombinant vaccines against PEP. For this, coding DNA sequence of MhSPase I, sipS, was cloned into the expression vector pGEX 4T-3 and expressed in Escherichia coli. Recombinant MhSPase I (rMhSPase I) was purified and used in immunization of mice. The immunogenicity of rMhSPase I was evaluated by ELISA, being highly immunogenic for mice. Cellular immune response induced was characterized through cytokine secretion by mice splenocytes in culture, stimulated with rMhSPase I. This antigen induced a strong Th2 cellular response, with high secretion levels of interleukin-10. In parallel, MhSPase I functional activity was analyzed by in vivo complementation assays in E. coli SPase I mutant. From this assay, was observed which MhSPase I is able to complement the SPase I activity of E. coli, allowing the bacterial survive, being essential for cell viability. These results demonstrate that MhSPase I may be a good target to development of recombinant vaccines against PEP, once is able to induce immune response and is fundamental for bacterial survive.