Método de detecção e caracterização de transgenes inseridos em Eucalyptus geneticamente modificado

Abstract

Os Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) ou transgênicos ganharam destaque mundial em decorrência de suas várias aplicações e benefícios gerados. Plantas GM foram desenvolvidas com características como a maior resistência a doenças e pragas; a maior tolerância a estresses abióticos; o maior incremento de conteúdo nutricional; e, também, no desenvolvimento de produtos como fármacos peptídicos e metabólitos secundários. Nos últimos anos houve um aumento significativo no número de países que adotou o cultivo de plantas GM, chegando, em 2014, a 28 países produtores. As agências reguladoras de plantas transgênicas e de outros OGMs de diversos países, porém, exigem uma série de testes e análises de segurança para que estes organismos sejam liberados para o cultivo e a comercialização. Análises baseadas na detecção e na caracterização do DNA exógeno inserido no genoma das plantas, visando determinar os locais de integração e o número de cópias integradas, fazem parte das típicas exigências destas agências reguladoras. Estes testes são realizados principalmente por técnicas como a hibridização de Southern blot e a reação em cadeia da DNA polimerase (PCR). Estes métodos, no entanto, apresentam limitações no seu uso e na qualidade e aproveitamento dos resultados gerados, sendo necessário o desenvolvimento de novas metodologias de análise. Pelo presente trabalho, teve-se por objetivo o desenvolvimento de um novo método de detecção e caracterização de eventos de transformação de plantas GM em substituição às técnicas previamente citadas. A estratégia proposta faz uso dos marcadores moleculares denominados “Polimorfismos de Comprimento de Fragmentos Amplificados” (do inglês, Amplified Fragment Length Polymorphism ou AFLP). Para desenvolvimento e teste da nova metodologia, foi realizada a extração de DNA de amostras de folhas de Eucalyptus GM e não-GM. Testes qualitativos e quantitativos, atestando a pureza das amostras de DNA, foram realizados a fim de dar continuidade aos experimentos com AFLP. Foram realizados o planejamento e a projeção de primers e adaptadores específicos às sequências do DNA exógeno integrado nas plantas. Uma vez estabelecidos todos os materiais e passos necessários para iniciar a técnica de AFLP, a reação de clivagem do DNA genômico e a ligação dos adaptadores aos fragmentos gerados foi cumprida com sucesso e, assim, seguiu-se com as análises via PCR. Para a constatação da eficácia e sucesso da técnica, produtos da PCR foram analisados por eletroforese capilar em um sequenciador de DNA ABI-3500 (Applied Biosystems). Assim, foi possível avaliar o número de fragmentos gerados pelas combinações de 14 diferentes primers testados. A combinação do primer MseI-AG gerou um número maior de fragmentos e, desta forma, foi escolhido para as análises iniciais. Pela comparação dos fragmentos obtidos de mais de uma amostra de DNA, pode-se fazer uma correlação entre a ausência e a presença dos picos gerados. Assim, os fragmentos que se mostrarem exclusivos nas amostras, isto é, presentes ou ausentes, indicarão os possíveis transgenes inseridos no genoma de Eucalyptus. Foi possível obter uma variedade de tamanhos de fragmentos pelo primer MseI-AG. Os fragmentos de 79, 100 e 378 pares de bases foram detectados em amostras únicas de Eucalyptus, sendo específicos para cada amostra avaliada. Por serem exclusivos de cada amostra, esses fragmentos possivelmente indicam ser originados dos transgenes inseridos no genoma de Eucalyptus GM. Estes estudos ainda são preliminares e devem ser realizados na presença de uma amostra controle (Eucalyptus não-GM), que se conheça os tamanhos de fragmentos, para a correta detecção dos fragmentos gerados por Eucalyptus GM. Logo, para o melhor aperfeiçoamento da nova tecnologia proposta, um maior número de amostras de plantas GM e não-GM serão analisadas.

Genetically Modified Organisms (GMOs) or transgenics gained worldwide prominence due to their many applications and benefits. GM plants were generated in order to improve their resistance to diseases and pests; to improve their tolerance to abiotic stresses; to increase their nutritional content; and also to develop products such as peptide drugs and secondary metabolites. In the last years, a significant increase in the number of countries that adopted the cultivation of GM crops has happened, with 28 countries producing GM crops in 2014. The regulatory agencies of transgenic plants and other GMOs in many countries however require a series of tests and safety analyzes prior to planting and commercializing them. Analyses based on the detection and characterization of inserted DNA into plant genomes are among the typical results requested by those agencies in order to define the places and the number of integrated copies. These tests are mainly performed by Southern blot hybridization and polymerase chain reaction (PCR) techniques. These methods however have limitations on their use and interpretation of obtained results, requiring the development of new methods of analysis. The present work was conceived with the aim to present a new method of detection and characterization of GM plant transformation events in substitution of the previously referred techniques. The proposed strategy was carried out with the use of a molecular marker technic called "Amplified Fragment Length Polymorphism" (AFLP). In order to develop and test it, genomic DNA was extracted from leaves of GM and non-GM Eucalyptus. Qualitative and quantitative tests were performed to assess the purity of DNA samples to continue the experiments with AFLP. Planning and design of primers and specific adapters to transgene sequences were performed. When all materials and steps necessary to begin the AFLP technique were established, reactions of genomic DNA restriction and ligation were successfully accomplished followed by PCR analyses. For verification of the effectiveness and success of the technique, PCR products were analyzed by capillary electrophoresis in an ABI-3500 DNA sequencer (Applied Biosystems). Thus, it was possible to evaluate the number of fragments generated by the 14 different tested primer combinations. The primer combination MseI-AG generated a greater number of fragments and therefore, was chosen for initial analysis. By comparing the fragments obtained from more than one DNA sample, it is possible to make a correlation between the absence and presence of the peaks generated. The fragments show specific outcomes in each sample, i. e, present or absent, and will indicate the possible inserted transgenes into the plant genome. Therefore, it was possible to obtain a variety of fragment sizes by MseI-AG primer. The fragments of 79, 100 and 378 base pairs were detected in unique Eucalyptus samples, being specific for each sample evaluated. For being unique in each sample, these fragments possibly indicate to have originated from the transgene inserted into the Eucalyptus genome. These studies are still preliminary, and should be performed in the presence of a control sample (non-GM Eucalyptus) in which the sizes of the fragments generated are known for the correct comparison of the unique fragments of Eucalyptus GM. A larger number of samples of GM and non-GM plants will be analyzed for the improvement of the new proposed technology.