Clonagem molecular, expressão e caracterização da transglutaminase de Paenibacillus sp. JDR-2 em Escherichia coli

Abstract

Transglutaminases são proteínas que catalisam a formação de uma ligação cruzada entre uma amina primária e o grupamento carboxamida presente em resíduos de glutamina, possuindo um importante papel na re-estruturação de alimentos proteináceos na indústria de alimentos. Paenibacillus sp. JDR-2 é uma bactéria Gram-positiva relacionada filogeneticamente com outros microrganismos produtores de transglutaminases, como aqueles do gênero Bacillus, sendo, portanto, um possível produtor desta enzima. Estre trabalho visou a identificar genes codificadores de transglutaminases presentes no genoma de Paenibacillus sp. JDR-2 in silico e expressar essas sequências em um sistema heterólogo para sua caracterização. Uma busca por genes codificadores de transglutaminases foi feita através da procura por ORFs que foram anotadas como contendo um domínio de transglutaminase e depositadas no NCBI. Primers específicos foram projetados para amplificar três destas ORFs, que foram então amplificadas por PCR e clonadas no vetor de expressão pET23d+. Os plasmídeos recombinantes gerados foram transformados em três linhagens hospedeiras de Escherichia coli para a síntese das proteínas recombinantes, cujos extratos foram analisados por SDS-PAGE e a atividade enzimática verificada pelo teste do hidroxamato. A análise in silico mostrou a presença de dez transglutaminases codificadas pelo genoma de Paenibacillus sp. JDR-2, sendo nove sequências identificadas como possíveis transglutaminases e uma destas sendo uma sequência truncada que foi, portanto, descartada de futuras análises. As sequências nucleotídicas das ORFs 4765, 4870 e 5011 foram clonadas em vetor pET23d+ e os plasmídeos recombinantes gerados foram transformados em E. coli, mas apenas com o vetor contendo a sequência da ORF 4765 transformado em E. coli Arctic Express foi observada a expressão da proteína recombinante, apesar de esta estar totalmente na fração insolúvel. Tentativas de resolubilizar a proteína 4765 utilizando condições não-desnaturantes foram eficientes, mas a proteína não mostrou qualquer atividade enzimática de transglutaminase. As próximas etapas deste trabalho envolvem a tentativa de solubilizar a proteína 4765 com um método de desnaturação protéica seguido pelo seu refolding para verificar sua atividade, e clonar as sequências 4870 e 5011 em novos vetores para expressão em E. coli e também em vetores para expressão em Pichia pastoris.

Transglutaminases are proteins that catalyze the formation of a crosslink between a primary amine and the γ-carboxamide group of protein-bound glutamine, having an important role in the food industry in the production of re-structured food. Paenibacillus sp. JDR-2 is a Gram-positive microorganism closely related to known transglutaminase-producing organisms, such as Bacillus sp.. This study aimed to identify transglutaminase-coding DNA sequences in the genome of Paenibacillus sp. JDR-2 in silico and to express these sequences in a heterologous system in order to characterize the recombinant enzymes. We searched for predicted genes encoding transglutaminase-domains from Paenibacillus sp. JDR-2 that were identified by automated annotation and deposited in the NCBI database. Specific primers were designed to amplify three predicted transglutaminase-coding ORFs from the genomic DNA of Paenibacillus sp. JDR-2 by PCR and cloning into the vector pET23d+. Recombinant plasmids were transformed into expression strains of Escherichia coli for the synthesis of the recombinant proteins and analyzed by SDS-PAGE, followed by the hydroxamate assay to test for transglutaminase activity. In silico analysis indicated the presence of ten putative transglutaminases in Paenibacillus sp. JDR-2, with one being a truncated protein, which was therefore not persued. The predicted DNA sequences of the ORFs 4765, 4870 and 5011 were cloned into the expression vector pET23d+ and transformed into three expression strains of E. coli, however only the protein encoded by ORF 4765 was expressed. The protein was only expressed under low temperature conditions in E. coli Arctic Express, but it was completely insoluble. Attempts to solubilize this protein using non-denaturing conditions yielded soluble protein with no catalytic activity. The next steps are to clone the ORFs 4870 and 5011 into other expression vectors for expression in E. coli and Pichia pastoris, and to solubilize the inclusion bodies containing the protein encoded by ORF 4765 using denaturing conditions followed by refolding to obtain a soluble enzyme for tests for transglutaminase activity.