Identificação de sequências promotoras e terminadoras preditas no genoma de Mycoplasma hyopneumoniae e sua influência na transcrição gênica

Abstract

A espécie Mycoplasma hyopneumoniae está associada a suínos, sendo conhecida por ser o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, doença que afeta o trato respiratório destes animais, gerando significativas perdas econômicas na área da suinocultura. Trata-se de uma bactéria com genoma pequeno (0,92 Mb), com baixo conteúdo G+C (28 %), e classificada como gram-negativa, mas filogeneticamente próxima às bactérias gram-positivas. Até o momento, seis linhagens de M. hyopneumoniae tiveram seus genomas sequenciados: as patogênicas, 7448, 232, 7422, 168 e 168-L, e a não-patogênica, J. A linhagem de M. hyopneumoniae 7448 foi utilizada em diversos trabalhos por nosso grupo, com o objetivo de melhor caracterizar seu genoma e sua organização gênica. Em um trabalho realizado por Siqueira et al. (2011) foi determinado que o genoma de M. hyopneumoniae está organizado em Unidades Transcricionais (UTs), cujo os genes são transcritos de forma policistrônica. Posteriormente, Weber et al. (2012) realizaram predições de promotores no genoma de M. hyopneumoniae, onde estes elementos foram classificados como promotores fortes ou fracos. De acordo com o resultado da predição in silico, os promotores estão posicionados tanto em regiões intergênicas, quanto dentro de UTs. Recentemente, Fritsch et al. (2015) realizaram predições in silico de terminadores transcricionais no genoma de M. hyopneumoniae, utilizando três diferentes softwares. Assim como os promotores, estes elementos também foram preditos em regiões intergênicas e dentro de UTs. A existência destes elementos dentro de UTs corrobora com a hipótese de que promotores e terminadores internos exerçam influência sobre os níveis de expressão gênica dos genes que compõem cada unidade policistrônica. A confirmação parcial desta hipótese foi realizada através de análises da expressão gênica de nove genes alvo, onde foi possível observar variação dos níveis de transcritos entre os genes de uma mesma UT (Siqueira et al., 2014 A). Paralelamente a estes estudos, foram realizadas, em nosso laboratório, análises dos transcritomas das três espécies de Mycoplasma que habitam o trato respiratório de suínos, que revelaram o perfil de expressão gênica dos genes de M. hyopneumoniae, Mycoplasma flocculare e Mycoplasma hyorhinis (Siqueira et al., 2014 B). Através deste trabalho, foi possível determinar a existência de genes com altos níveis de expressão em condições de cultivo padrão, e confirmar que a transcrição em longas UTs também é uma característica dos genomas de M. flocculare e M. hyorhinis. Trabalhos realizados por outros grupos também demonstraram níveis de expressão gênica diferenciais em condições adversas de crescimento de M. hyopneumoniae, como estresse térmico (Madsen et al., 2006) e estresse oxidativo (Schafer et al., 2007), através de microarranjo. O atual trabalho tem como objetivo a integração das informações conhecidas até então sobre elementos reguladores da transcrição, para localizar as sequências promotoras e terminadoras da transcrição preditas in silico, considerando a organização gênica, no genoma de M. hyopneumoniae 7448, e determinar a influência destes elementos sobre a expressão gênica de alvos específicos em condições de estresse térmico e oxidativo. Para isso, inicialmente, foi realizado um refinamento dos dados obtidos nas predições de promotores e terminadores realizadas anteriormente (Weber et al., 2012; Fritsch et al., 2015), empregando parâmetros mais restringentes quanto ao posicionamento destas sequências. Em seguida, as UTs de M. hyopneumoniae foram classificadas de acordo com a ocorrência destes elementos. Posteriormente, foram realizados cultivos de M. hyopneumoniae 7448 em meio Friis, em três condições diferentes: i) controle: cultivado em meio Friss líquido a 37 ºC por 24 h; ii) estresse térmico: cultivo igual ao controle, seguido de incubação a 30 ºC por 2 h, e a 42 ºC por 30 min (Madsen et al., 2006); e, iii) estresse oxidativo: cultivo igual ao controle, seguido da adição de 1 % de peróxido de hidrogênio e incubação a 37 ºC por 15 min (Schafer et al., 2007). Para cada condição de cultivo foram realizadas extrações em duplicata de RNA de M. hyopneumoniae através do kit Illustra™ RNAspin Mini RNA isolation kit (GE Healthcare Life Sciences). O RNA extraído foi tratado com DNase I (Fermentas) para remoção completa de DNAs contaminantes, e a confirmação do tratamento foi realizada através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). Em seguida, foi realizada a síntese de DNA complementar (cDNA) através de reações de Transcrição Reversa (RT). Os cDNAs foram utilizados como molde para o PCR quantitativo (qPCR). Os genes alvo deste trabalho foram selecionados apresentam maior representatividade no transcritoma de M. hyopneumoniae na condição padrão de cultivo (Siqueira et al., 2014 B), ou são regulados positiva ou negativamente nas condições de estresse oxidativo (Schafer et al., 2007), estresse térmico (Madsen et al., 2006). O cálculo de expressão relativa dos mRNAs foi realizado através do método 2-ΔCT (LIVAK et al., 2001), corrigido de acordo com o valor de eficiência dos primers. Os valores de expressão dos genes controle das condições de estresse e dos genes alvo foram normalizados em relação ao valor de expressão do gene MHP7448_0333. Para cada gene alvo foram realizadas triplicatas técnicas e duplicatas biológicas. As análises estatísticas da expressão relativa dos genes alvo e da comparação dos genes de uma mesma UT foram realizadas através do software GraphPad Prism 6, utilizando o teste One-way ANOVA by Tukey’s multi comparision (P<0,05). Os resultados obtidos neste trabalho permitiram um maior conhecimento sobre a organização do genoma de M. hyopneumoniae, e a influência de promotores e terminadores sobre a regulação da expressão gênica deste organismo, nas diferentes condições de cultivo testadas.