Estudos para a clonagem molecular e expressão de transglutaminase de Paenibacillus sp. JDR-2 em Pichia pastoris

Abstract

A transglutaminase é uma enzima de grande importância para a indústria de alimentos, uma vez que catalisa a formação de reações de acil-transferência entre grupos γ-carboxamida em resíduos de glutamina, provocando alterações nas propriedades protéicas. O Paenibacillus sp. JDR-2 é uma bactéria gram-positiva, que está relacionada filogeneticamente com o gênero Bacillus, assim como com outros microorganismos produtores de transglutaminase, portanto, supõe-se que este é um possível produtor desta enzima. O trabalhou teve o intuito de identificar genes codificadors de transglutaminase no genoma do Paenibacillus sp. JDR-2 in silico e expressar algumas dessas sequências em sistema heterólogo. Foi realizada uma busca por genes codificadores de transglutaminase através da procura de ORFS que continham domínio de transglutaminase, estas foram anotadas e depositadas no NCBI. Foram verificadas a presença de dez possíveis transglutaminases codificadas pelo genoma do Paenibacillus sp. JDR-2, sendo que uma desta não apresentava aminoácido iniciador, e, portanto, foi descartada. As sequências 4870 e 5011 foram escolhidas para utilização neste trabalho, uma vez que o peso molecular preditos, correspondem às características encontradas nas transglutaminases bacterianas. Primers foram desenhados para a amplificação destas sequências e deveriam ser clonados no vetor pPICZα. Primeiramente, tentou-se clonar pelo método de ligação em E. coli DH10B, entretanto, as colônias formadas não apresentaram evidências que continham os insertos escolhidos. Após, foi realizada a clonagem por CPEC, já que está técnica apresenta maior especificidade. Mais uma vez a clonagem não foi efetiva, não apresentando o crescimento de colônias. Os próximos passos seriam realizar novas tentativas e, se estas fossem positivas, realizar a transformação dos plasmídeos purificados em Pichia pastoris, considerando este sistema mais eficiente para modificações pós-traducionais.

Transglutaminase is an important enzyme that catalyzes acyl-transfer reaction between γ-carboxamide groups of glutamine residues causing modifications in the protein proprieties. Paenibacillus sp. JDR-2 is a gram-positive bacterium that is phylogenetically related with Bacillus gender and to other microorganisms that produce transglutaminase. Therefore this microorganism could be a possible producer of this enzyme. The aim of the present research was to identify possible genes sequences encoding transglutaminase, in silico, in the Paenibacillus sp. JDR-2 genome and to express some of them in a heterologous system. We searched for predicted genes encoding transglutaminase domains from Paenibacillus sp. JDR- 2, which were noted and deposited in the NCBI database. There were ten observed possible transglutaminases encoded by the genome of Paenibacillus sp. JDR-2, but one of them did not present an essential amino acid (primer), being discharged. In this study, the sequences 4870 and 5011 were chosen, since they present the predicted molecular weight, which corresponds to features found in bacterial transglutaminases. Primers were designed for the amplification of these sequences, which could be cloned into the vector pPICZα. First, we tried to clone by ligation in E. coli DH10B; however, the colonies showed no evidence of containing the chosen inserts. Therefore, we tried the cloning by CPEC methodology, since this technique introduces higher specificity. Again cloning was not effective, showing no growth of colonies. The next step would be to perform new attempts at cloning, and, if positive, performing the processing of purifying the plasmids and introduce them in Pichia pastoris, considering this system more efficient for post-translational modifications.