Identificação de espécies de lactobacilos mediante sequenciamento parcial de genes constitutivos

Abstract

O sequenciamento do gene 16S rRNA apresenta limitações na identificação de espécies de Lactobacilos devido à presença de polimorfismos e de múltiplas cópias deste gene. No sentido de aprimorar a classificação filogenética e superar estas limitações surge a proposta do uso de genes constitutivos, também chamados housekeeping genes, que são genes responsáveis pelo metabolismo bacteriano na identificação de lactobacilos. O presente estudo teve como objetivo avaliar o uso dos genes constitutivos pheS (subunidade α da fenilalanina), rpoA (subunidade α da RNA polimerase) e groEL (hsp60 ou 60-kDa proteína de choque térmico) na identificação de espécies de lactobacilos orais mediante o sequenciamento parcial destes genes. A metodologia utilizada consistiu na extração do DNA bacteriano de amostras de dentina, seguida pela amplificação dos genes pheS, rpoA e/ou groEL por PCR e sequenciamento dos mesmos. As sequências foram comparadas quanto à sua homologia com sequências de nucleotídeos do banco de dados do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) dos Estados Unidos. Definiu-se que similaridades deveriam ser iguais ou superiores a 97% para classificação das espécies. Os lactobacilos identificados nesse estudo pertencem às espécies de L. paracasei (n= 41), L. rhamnosus (n= 32), L. plantarum (n=1). Na identificação de lactobacilos orais tanto o gene pheS quanto o gene groEL são marcadores filogenéticos confiáveis e com bom poder discriminatório. No entanto, para os L. rhamnosus o gene groEL mostrou-se mais eficiente do que o gene pheS. O gene rpoA não mostrou-se efetivo como marcador filogenético para lactobacilos orais. Assim, sugere-se o uso do sequenciamento parcial do gene groEL como primeira alternativa na identificação genotípica de lactobacilos orais e, em casos de não amplificação, o gene pheS pode ser utilizado.

The 16S rRNA gene sequencing shows limitation on Lactobacillus species identification due to the presence of polymorphisms and multiple copies of this gene. In order to improve phylogenetic classification and overcome this limitations, it was introduced the proposal of the study is to use constitutive genes, also called housekeeping genes, that are responsible for the bacterial metabolism for lactobacillus identification. The present study aims to evaluate the use of pheS (α fenilalanin subunit), rpoA (α of RNA polymerase subunit) and groEL (hsp60 ou 60-kDa thermal shock proteins) genes partial sequencing in the identification of oral Lactobacillus species. The present approach consisted of DNA extraction of lactobacilli previous isolated from dentin, followed by the PCR amplification of the genes pheS, rpoA and/or groEL genes and sequencing. The sequences were compared by the homology with sequences from the National Center of Biotechnology Information (NBCI) of United States database nucleotides. Similarities were defined to be equal or higher than 97% for species taxonomy. The lactobacilli identified from this study were L. paracasei (n= 41), L. rhamnosus (n= 32), L. plantarum (n=1) species. For the lactobacilli identification either pheS gene or groEL gene were reliable phylogenetic markers with good discriminatory capacity. However, for L. rhamnosus the gene groEL was more efficient than pheS. The rpoA gene was not an effective filogenetic marker. Hence, it is suggested that the partial sequence of the groEL gene should be the first alternative on oral lactobacillus genotypic identification, and when its amplification is not possible, pheSgroEL gene should be used instead.