Expressão da manoproteína MP43 de Cryptococcus gattii em Pichia pastoris

Abstract

Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são leveduras encapsuladas e os principais agentes causadores da criptococose. Essa infecção é caracterizada por atingir os pulmões e se disseminar para o sistema nervoso central, causando meningite. C. neoformans infecta principalmente pacientes imunocomprometidos, embora já existam relatos de infecção em pacientes saudáveis. Já C. gattii infecta indivíduos imunocompetentes. As manoproteínas, que correspondem a aproximadamente 1% da composição da cápsula de Cryptococcus, são altamente imunogênicas e induzem resposta imune mediada por células T durante a infecção em modelo murino. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho é avaliar o potencial imunoterapêutico de uma manoproteína de C. gattii recombinante em ensaios de infecção experimental. Análises in silico do genoma de C. gattii evidenciaram a presença de um gene codificador de uma manoproteína com massa predita de 43 kDa, anotada como proteína hipotética conservada, a qual denominamos MP43. Essas análises sugerem que MP43 possui todas as características essenciais de uma manoproteína: uma região rica nos aminoácidos serina e treonina, em que as manoses são adicionadas; um domínio C-terminal de ancoramento à GPI; e uma região na porção N-terminal onde se localiza um peptídeo sinal para secreção. Com o intuito de expressar MP43 em Pichia pastoris para posterior purificação e utilização em ensaios de avaliação do potencial imunoterapêutico no tratamento da criptococose, primers foram projetados a fim de eliminar as regiões do peptídeo sinal e da âncora de GPI, para maior eficiência durante a purificação. O fragmento correspondente à região codificadora de MP43 foi amplificado e clonado no plasmídeo pHIL-S1, amplamente utilizado em sistemas de expressão em P. pastoris. Esse vetor possui uma sequência que codifica um peptídeo sinal e um promotor induzido por metanol. A confirmação da construção foi realizada por clivagem com a enzima BglII e posterior sequenciamento. A transformação em P. pastoris foi realizada através de eletroporação de células competentes de duas linhagens diferentes da levedura: KM71, que possui o gene AOX1 que codifica a enzima álcool oxidase deletado e GS115, que possui o gene AOX1 intacto. Ambas as linhagens possuem o gene HIS4 não funcional. Inicialmente foram obtidas 4 colônias recombinantes, duas da linhagem KM71 e duas da linhagem GS115. A expressão heteróloga da MP43 nessas quatro linhagens não foi bem sucedida e estamos realizando outro processo de transformação para avaliação de novos transformantes. Após a expressão e purificação da manoproteína MP43 serão realizados testes para avaliar o potencial imunoterapêutico da mesma em modelo murino de criptococose.

Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii are encapsulated yeasts, the etiological agents of cryptococcosis in humans. This disease is characterized by lung infection that may spread to the brain, causing meningoencephalitis. C. neoformans infects preferentially patients with compromised immune system, while C. gattii has the ability to infect immunocompetent individuals. The mannoproteins, which correspond to approximately 1% of the composition of Cryptococcus capsule, are highly immunogenic and elicit immune responses mediated by T cells during the infection in a murine model. In this context, the aim of this study is to evaluate the immunotherapeutic potential of one recombinant mannoprotein of C. gattii in trials of experimental infection. In silico analysis of the C. gattii genome revealed the presence of one mannoprotein with a predicted molecular mass of 43 kDa, annotated as a conserved hypothetical protein, which we named MP43. This analysis suggested that MP43 has all the essentials features of a mannoprotein: a serine-threonine-rich region; one C-terminal domain for GPI anchoring; and a signal peptide on the N-terminal domain for secretion. In order to express the mannoprotein MP43 in Pichia pastoris for subsequent purification and use in immunotherapeutic trials, primerswere designed to eliminate the regions that code for the signal peptide and the GPI anchor, to increase the efficiency during the purification. The fragment was amplified and cloned into the pHIL-S1 plasmid, widely used in P. pastoris expression systems. This vector comprises a sequence encoding a signal peptide and a promoter induced by methanol. The confirmation of the construct was made by cleavage with BglII and subsequent sequencing. Transformation of P. pastoris was carried out by electroporation with competent cells of two different strains of the yeast: KM71, which has the AOX1 gene that encodes alcohol oxidase enzyme deleted and GS115, which has the AOX1 gene intact. Both strains have the HIS4 gene not functional. The insertion of the vector into the yeast genome occurred via homologous recombination and the transformants were selected for histidine auxotrophy. Initially, four recombinant colonies were obtained, two of the KM71 strain and two of the GS115 strain. The heterologous expression of MP43 in these four strains was not successful and we are now performing another transformation process for the evaluation of new transformants. After the expression and purification of the recombinant MP43 of C. gattii, tests will be conducted to evaluate the immunotherapeutic potential in a murine model of cryptococcosis.