Efeitos do sulfito e do tiossulfato sobre a homeostase energética e redox e função mitocondrial em cérebro de ratos

Abstract

O sulfito e o tiossulfato estão acumulados em tecidos e líquidos biológicos de pacientes afetados pela deficiência da sulfito oxidase (SO), uma enzima mitocondrial que catalisa a oxidação de sulfito derivado do metabolismo de aminoácidos sulfurados. A deficiência da SO é causada pela deficiência isolada da enzima SO ou por uma deficiência na rota de biossíntese de seu cofator molibdênio. Os indivíduos afetados por esta desordem apresentam disfunção neurológica progressiva, convulsões neonatais severas, subluxação do cristalino, hipotonia axial, hipertonicidade periférica e atraso no desenvolvimento, resultando geralmente em morte prematura. Considerando que a fisiopatologia do dano neurológico encontrado em pacientes deficientes para a SO ainda não está esclarecida, o objetivo do presente trabalho foi investigar os efeitos in vitro do sulfito e do tiossulfato sobre parâmetros de metabolismo energético e homeostase redox e mitocondrial em cérebro de ratos jovens. Inicialmente, verificamos que o sulfito inibe a atividade do complexo IV da cadeia respiratória, indicando que este composto prejudica o fluxo de elétrons, enquanto que o tiossulfato não afetou a atividade de nenhum dos complexos da cadeia respiratória em sobrenadantes de córtex cerebral. Também foi verificado que o sulfito e o tiossulfato diminuem a atividade da creatina quinase total (tCK) e de suas isoformas mitocondrial e citosólica, sugerindo que estes compostos prejudicam o tamponamento e a transferência de energia celular no cérebro. Além disso, melatonina, trolox (análogo solúvel do α-tocoferol), glutationa e o inibidor da óxido nítrico sintase Nω-nitro-L-arginina metil éster atenuaram ou preveniram totalmente a inibição da tCK induzida por sulfito e tiossulfato, sugerindo o envolvimento de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio nestes efeitos. O sulfito e o tiossulfato também aumentaram a oxidação da 2’,7’-diclorofluorescina e inibiram a atividade da aconitase, enquanto que somente o sulfito aumentou a produção de peróxido de hidrogênio, reforçando o envolvimento de dano oxidativo nos efeitos provocados por estes metabólitos. Contudo, a atividade da enzima Na+,K+-ATPase sináptica não foi alterada pelo sulfito e tiossulfato. Em seguida, observamos que o sulfito dissipa o potencial de membrana mitocondrial na presença de Ca2+, de forma dose-dependente de sulfito e Ca2+ em preparações mitocondriais de cérebro de ratos. O sulfito também induziu inchamento e diminuiu a capacidade de retenção de Ca2+, os níveis de NAD(P)H na matriz e o imunoconteúdo de citocromo c em mitocôndrias quando Ca2+ estava presente no meio. Além disso, as alterações provocadas pelo sulfito foram prevenidas por rutênio vermelho, ciclosporina A e ADP, sugerindo que o sulfito induz transição da permeabilidade mitocondrial (MPT). Também foi verificado que dentre vários inibidores da MPT, incluindo antioxidantes, inibidores da fosfolipase A2 e o regente redutor ditiotreitol, apenas o agente alquilante de tióis N-etilmaleimida foi capaz de prevenir o inchamento mitocondrial causado por sulfito. O sulfito também diminuiu o conteúdo de grupamentos tiol de proteínas de membrana em preparações mitocondriais de cérebro, indicando que este composto age diretamente sobre grupamentos tiol contidos no poro de MPT. Assim, pode-se presumir que o prejuízo no metabolismo energético e na homeostase redox causados pelo sulfito e pelo tiossulfato e que a indução de MPT pelo sulfito podem estar envolvidos na disfunção neurológica observada nos portadores da deficiência da SO.

Sulfite and thiosulfate accumulate in tissues and biological fluids of patients affected by the deficiency of sulfite oxidase (SO), which is a mitochondrial enzyme that catalyzes the oxidation of sulfite derived from the metabolism of sulfur amino acids. SO deficiency is caused by the isolated deficiency of the enzyme SO itself or by a deficiency in the biosynthetic pathway of its molybdenum cofactor. Individuals affected by this disorder present progressive neurological dysfunction, severe neonatal seizures, lens subluxation, axial hypotonia, limb hypertonicity and failure to thrive, resulting often in early childhood death. Considering that the pathophysiology of the neurological damage found in SO deficient patients has not been totally established, the aim of the present work was to investigate the in vitro effect of sulfite and thiosulfate on parameters of energy metabolism, as well as redox and mitochondrial homeostasis in rat brain. First, we verified that sulfite inhibited the activity of complex IV of the respiratory chain in cerebral cortex supernatants, indicating that this compound impairs the electron transfer flow, whereas thiosulfate did not affect any of the activities of the respiratory chain complexes. It was also found that sulfite and thiosulfate markedly decreased the activity of total creatine kinase (tCK) and its mitochondrial and cytosolic isoforms, suggesting that these compounds impair brain cellular energy buffering and transfer. Moreover, melatonin, trolox (soluble analogue of α-tocopherol), glutathione and the nitric oxide synthase inhibitor Nω-nitro-L-arginine methyl ester attenuated or fully prevented the inhibition of tCK induced by sulfite and thiosulfate, suggesting the involvement of reactive oxygen and nitrogen species in these effects. Sulfite and thiosulfate also increased 2’,7’-dichlorofluorescin oxidation and inhibited the activity of aconitase, whereas only sulfite increased hydrogen peroxide production, reinforcing the involvement of oxidative damage in the effects elicited by these metabolites. In contrast, synaptic Na+,K+-ATPase activity was not altered by sulfite and thiosulfate. Next, we observed that sulfite dissipates mitochondria membrane potential in the presence of Ca2+, in a sulfite and Ca2+ dose-dependent manner. Sulfite also induced swelling and decreased Ca2+ retention capacity, matrix NAD(P)H pool and cytochrome c immunocontent in mitochondria when Ca2+ was present in the medium. Furthermore, the alterations elicited by sulfite were prevented by ruthenium red, cyclosporine A and ADP, supporting the involvement of mitochondrial permeability transition (MPT) in these effects. It was also verified that among various MPT inhibitors, including antioxidants, phospholipase A2 inhibitors and the reductant reagent dithiothreitol, only the thiol alkylating agent N-ethylmaleimide was able to prevent the sulfite-elicited mitochondrial swelling. Moreover, sulfite decreased membrane protein thiol group content in brain mitochondria, indicating that this compound acts directly on MPT pore containing thiol groups. Taken together, it may be presumed that the mitochondrial energy and redox homeostasis impairment caused by sulfite and thiosulfate and MPT induced by sulfite may be involved in the neurological dysfunction observed in patients affected by SO deficiency.