Taxas de clivagem e de formação de blastocistos bovinos produzidos in vitro após a adição de oócitos desnudos ao sistema de maturação

Abstract

Apesar dos avanços nos procedimentos de maturação, fecundação e cultivo in vitro a porcentagem de embriões produzidos capazes de se desenvolver até o estágio de blastocisto ainda é reduzida. Segundo Gilchrist et al. (2010) um dos principais fatores que afeta esta taxa de desenvolvimento embrionário é a incompetência do oócito em realizar a maturação. Com o objetivo de aumentar esta eficiência, têm-se estudado a interação entre fatores secretados pelos oócitos e a maturação oocitária. O objetivo deste experimento foi determinar as taxas de clivagem e de desenvolvimento embrionário até blastocisto, a partir de dois procedimentos de adição às gotas de MIV de oócitos desnudos (ODs). Os complexos Cummuli oócitos (CCOs) foram obtidos mediante punção de folículos com diâmetro entre 2 e 8 mm. Os CCOs que apresentaram cummulus compacto e citoplasma homogêneo foram selecionados para maturação e desnudamento. Os CCOs foram maturados em gotas de 50μL de meio de maturação (Meio TCM 199 modificado) sob óleo mineral e incubados a 38,5 oC em estufa com atmosfera de 5% de CO2 em ar e umidade relativa saturada. Aqueles selecionados para serem desnudos, permaneceram em TCM Holding [Meio 199 modificado]. Os oócitos foram desnudos com o auxilio de uma pipeta de vidro estirada em fogo. Os CCOs permaneceram 9 horas em meio de maturação quando foram colocados em cocultivo, respeitando-se a densidade de 0,5 ODs/μL. Parte dos CCOs foram postos nas gotas de maturação onde se encontravam os ODs (Grupo 1) e outra parte recebeu os ODs em suas gotas de maturação (Grupo 2). Os grupos Controle 50μL e Controle 100μL permaneceram em meio de maturação. Todos os grupos, experimentais e controles, permaneceram em maturação por 24 horas. A fecundação com sêmen reaquecido foi realizada durante 20 horas nas mesmas condições atmosféricas da maturação. As estruturas foram cultivadas em SOFm em gotas de 80μL, sob óleo mineral e foram mantidas a 38,3ºC em estufa de cultivo com atmosfera de 5% O2, 5% CO2 , 90% N2 e umidade relativa saturada. As taxas de clivagem foram avaliadas em D2 enquanto as taxas de blastocisto foram avaliadas em D7. Foram realizadas seis repetições. Os resultados foram analisados aplicando-se o teste do Qui-quadrado, para P<0,05. As taxas de clivagem não diferiram entre os grupos (C 100μL: 68,53%; C 50μL: 69,56%; G 1: 66,19%; G 2: 68,05%). Porém comparação das taxas de blastocisto obtidas entre os grupos houve diferença significativa. O grupo 2 mostrou-se superior quando comparado ao grupo controle de 50μL (23,38% e 13,04%, respectivamente).Os demais grupos não diferiram entre si (C 100μL: 14,60%; G1: 18,30%). Os resultados nos permitem concluir que a adição de ODs que secretaram FSOs ao meio de maturação não alterou as taxas de clivagem, mas promoveu maiores taxas de desenvolvimento embrionário ao estágio de blastocisto quando os ODs foram adicionados às gotas que já continham os CCOs.

In vitro maturation of oocytes, fertilization and development of blastocysts has been achieved in several species, however the rate of blastocyst development is still limited. According Gilchrist et al. (2010) this efficiency is limited by the oocyte competence. To improve these results, some research groups have studied the interaction among factors secreted by oocytes and oocyte maturation. The aim of our experiments was to determine the cleavage and blastocyst rates, from two procedures of addition of denuded oocytes (DOs) to IVM droplets medium. The Cumulli-oocyte complexes (COC) were recovered by aspiration of 2 to 8mm follicles using a 18 G needle. Oocytes with a compact Cumulus cells (CC) and homogeneous cytoplasm were selected for maturation and denudation. The COC were matured in 50 μL drops in TCM199 medium modified under mineral oil at 38.5oC in an humidified atmosphere of 5% CO2 in air. Denuded oocytes were generated by removing CCs from COCs by repeated passage of the oocytes through a fire-pulled glass pipette. The COCs remained 9 hours in IVM when they were placed in co-culture, respecting the density of 0.5 DOs/μL. COCs were randomly allocated into 2 treatment groups during IVM: group 1, COCs were placed into maturation medium droplets in which there were the DOs; group 2, DOs received the COCs into their maturation medium droplet. All groups, experimental and control, remained into IVM medium for 24 hours. Fertilization was performed with frozen-thawed semen and the oocytes were incubated with sperm for 20 hours into the same atmospheric conditions of IVM. The presumptive zigots were in vitro cultured (IVC) in SOFm in an humidified atmosphere 5% O2, 5% CO2 e 90% N2. Cleavage rates were evaluated in D2 while the blastocyst rates were evaluated in D7 after insemination. Six replicates were realized.The results were analyzed applying the chi-square, for P ≤ 0.05. The cleavage rates did not differed among the groups C 100μL: 68.53%; C 50μL: 69.56%; G 1: 66.19%; G 2: 68.05%). However, there was a significant difference on blastocyst rate. Group 2 was better than control group 50μL (23.38% e 13.04%, respectively). The other groups did not differ from each other (C 100μL: 14.60%; G1: 18.30%). In conclusion, the addition of FSOs to maturation medium did not modified the cleavage rates, but promotes more efficiently embryo development rates to the blastocyst stage when DOs are added to the drops that already contained the COCs.