Alterações na homeostase mitocondrial em camundongos com mucopolissacaridose tipo II

Abstract

A mucopolissacaridose do tipo II (MPS II) é uma doença lisossômica de depósito causada por variantes patogênicas no gene que codifica a enzima iduronato-2-sulfatase (IDS). Portanto, na MPS II, a enzima está deficiente, o que resulta no acúmulo de substratos não clivados dentro dos lisossomos, os glicosaminoglicanos (GAGs). Como consequência do acúmulo de GAGs não hidrolisados no interior dos lisossomos, há um aumento do tamanho e número dessa organela, culminando no aumento do tamanho celular. A MPS II é uma doença multissistêmica, tendo como manifestações clínicas hepatoesplenomegalia, comprometimento cognitivo, distúrbios comportamentais, problemas cardiorrespiratórios, dentre outros. Visto que a fisiopatologia da MPS II não é totalmente compreendida, avaliamos nesta tese o papel da homeostase mitocondrial na fisiopatologia dessa doença. As mitocôndrias são organelas importantes para a produção de ATP, homeostase do cálcio, produção de espécies reativas, sinalização e morte celular, além de terem pontos de contato físico com os lisossomos. Enfatize-se aqui que vários distúrbios do sistema periférico e do sistema nervoso central vem sendo associados a alterações na função mitocondrial. Portanto, neste trabalho foram avaliados parâmetros da função mitocondrial em fígado, coração e córtex cerebral de camundongos nocautes para a IDS (camundongos MPS II) de 6 meses de idade. No capítulo I desta tese, foi verificada uma diminuição na atividade da α-cetoglutarato desidrogenase e um aumento nas atividades da succinato desidrogenase, malato desidrogenase e complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em fígado de camundongos MPS II, sugerindo alterações na bioenergética. Além disso, foi visto um aumento nos níveis de malondialdeído e na oxidação de 2’,7’-diclorofluoresceína, indicando indução de peroxidação lipídica e aumento nos níveis de espécies reativas, respectivamente. Ainda, os níveis de grupamentos sulfidrilas e de glutationa reduzida, bem como as atividades da glutationa peroxidase, superóxido dismutase e catalase foram aumentadas no fígado dos animais nocaute. Finalmente, foi observada uma redução no conteúdo de Drp1, VDAC1 e COX IV bem como aumento de OPA1, indicando alterações na dinâmica e massa mitocondrial. Já no capítulo II, foi verificada uma alteração em proteínas envolvidas na interação entre mitocôndrias e lisossomos. Foi observada diminuição no conteúdo da TBC1D15 no córtex cerebral e coração de animais MPS II, e aumento no conteúdo de Rab7 apenas no coração. Também foram encontradas alterações no controle de qualidade mitocondrial, como a redução dos níveis de Drp1 (diminuição da fissão) e aumento de VDAC e COX IV (aumento da massa mitocondrial) no córtex cerebral e no coração dos animais MPS II. Já com relação à mitofagia, houve diminuição da Parkin no córtex cerebral e aumento no coração dos animais deficientes. Quanto à bioenergética, foi verificada redução nas atividades da citrato sintase e malato desidrogenase no córtex cerebral, e redução nas atividades da isocitrato desidrogenase, creatina cinase e piruvato cinase, bem como da respiração mitocondrial no coração de camundongos MPS II. Além disso, houve um aumento moderado na peroxidação lipídica apenas no coração. Nossos achados indicam que estresse oxidativo, disfunção bioenergética, e alterações na dinâmica mitocondrial e mitofagia estão envolvidas nas anormalidades hepática e cardíaca bem como nas manifestações neurológicas observadas na MPS II. Além disso, vimos que alterações na comunicação entre mitocôndrias e lisossomos também podem contribuir para explicar o dano neurológico e cardíaco dessa doença.

Mucopolysaccharidosis type II (MPS II) is a lysosomal storage disease caused by mutations in the gene that encodes the enzyme iduronate-2-sulfatase (IDS). Therefore, in MPS II, the deficient enzymatic activity results in the accumulation of undegraded substrates within the lysosomes, the glycosaminoglycans (GAGs). As a consequence of GAG accumulation, there is an increase in the size and number of lysosomes, culminating in an increased cell size. MPS II is a multisystemic disorder characterized by hepatosplenomegaly, cognitive impairment, behavioral disorders, and cardiorespiratory abnormalities, among others. Since the pathophysiology of MPS II is not fully understood, this thesis investigated on role of mitochondrial homeostasis in the pathophysiology of this disease. Mitochondria are important organelles for ATP production, calcium homeostasis, production of reactive oxygen species, signaling, and cell death. It should be emphasized here that various disorders of the peripheral and central nervous systems have been associated with alterations in mitochondrial function. Therefore, in this work, we evaluated mitochondrial homeostasis in the liver, heart, and cerebral cortex of 6-month-old IDS knockout mice (MPS II mice). In chapter I of this thesis, we verified a decrease in the activity of α-ketoglutarate dehydrogenase and an increase in the activities of succinate dehydrogenase, malate dehydrogenase, and complex I of the mitochondrial respiratory chain in the liver of MPS II mice, indicating alterations in bioenergetics. Furthermore, an increase in malondialdehyde levels and 2',7'-dichlorofluorescein oxidation was seen, suggesting induction of lipid peroxidation and increased levels of reactive species, respectively. In addition, the levels of sulfhydryl groups and reduced glutathione, as well as the activities of glutathione peroxidase, superoxide dismutase, and catalase were increased in the liver of the knockout animals. Finally, a reduction in the content of Drp1, VDAC1, and COX IV along with increased OPA1 was seen, indicating alterations in mitochondrial dynamics and mass. In chapter II, changes were observed in proteins involved in the interaction between mitochondria and lysosomes. There was a decrease in TBC1D15 content in the cerebral cortex and heart of MPS II animals, and an increase in Rab7 content only in the heart. Changes in mitochondrial quality control were also found, including reduced Drp1 levels (reduced fission) and increased VDAC and COX IV levels (increased mitochondrial mass) in the cerebral cortex and heart of MPS II animals. Regarding mitophagy, there was a decrease in Parkin levels in the cerebral cortex and an increase of this protein in the heart of deficient animals. As for bioenergetics, there was a reduction in the activities of citrate synthase and malate dehydrogenase in the cerebral cortex, and a reduction in the activities of isocitrate dehydrogenase, creatine kinase, and pyruvate kinase, as well as mitochondrial respiration in the hearts of MPS II mice. Moreover, there was a moderate increase in lipid peroxidation only in the heart. Our findings indicate that oxidative stress, bioenergetic dysfunction, and changes in mitochondrial dynamics and mitophagy are involved in the hepatic and cardiac abnormalities as well as the neurological manifestations observed in MPS II. Furthermore, we verified that changes in communication between mitochondria and lysosomes can also explain the neurological and cardiac damage caused by this disease.