Estudos de clonagem da transglutaminase de bacillus amyloliquefaciens em escherichia coli e sua produção em biorreatores

Abstract

As transglutaminases são enzimas amplamente utilizadas em vários processos industriais devido às suas propriedades de reticulação de proteínas, principalmente na indústria alimentícia no processamento de carnes, fabricação de queijos e outros produtos lácteos, panificação e produção de filmes comestíveis. Na área farmacêutica, vem sendo utilizada em reações de PEGilação, produção de conjugados anticorpo-droga, engenharia de tecido e medicina regenerativa. As transglutaminases também podem ser uma alternativa aos tratamentos químicos tradicionais no processamento da lã e do couro. Contudo, os custos extremamente altos da obtenção de transglutaminase de fontes animais impulsionaram as pesquisas na busca de novas fontes dessa enzima. Nestes casos, os esforços têm se concentrado na produção de transglutaminase por microrganismos, que podem apresentar um escopo de uso ainda mais amplo, devido a características específicas da transglutaminase microbiana (mTGase). Esta enzima, desde sua descoberta, tem sido produzida para aplicações industriais pelo processo tradicional de fermentação usando a bactéria Streptomyces mobaraensis. A transglutaminase de Bacillus (bTGase), descoberta mais recentemente, parece ser uma alternativa promissora à produção de TGase. Estudos anteriores demonstraram que, em comparação à transglutaminase comercial de Streptomyces mobaraense, a bTGase é mais estável em uma ampla faixa de pH e temperatura, porém, até o momento, poucos trabalhos foram feitos para produzir ou melhorar os rendimentos de transglutaminase de Bacillus.Por esta razão, os objetivos deste trabalho foram clonar e expressar o gene que codifica a TGase de Bacillus amyloliquefaciens em E. coli, obtendo a proteína em sua forma solúvel e ativa e estudar sua produção em biorreator. (continua). Para esse fim, foi construído um plasmídeo bicistrônico contendo o gene da transglutaminase de B. amyloliquefaciens fusionado ao prodomínio de Streptomyces caniferus para expressar a enzima como um zimogênio inativo. Além disso, foi clonado o gene da protease 3C para ativar a enzima, evitando a necessidade de remover o prodomínio in vitro. A proteína foi então purificada usando um protocolo de purificação em uma única etapa e identificada por espectrometria de massa. A atividade da bTGase recombinante foi investigada por ensaios de reticulação da albumina de soro bovino e por fluorescência, demostrando uma atividade específica de 37 mU/mgproteina quando as células recombinantes foram cultivadas em agitador orbital. Com o intuito de melhorar a 8 produção de transglutaminase, foram estudadas estratégias de cultivo em biorreatores em batelada e batelada alimentada (DO-stat). Após 30 h de cultivo em batelada, foram obtidos 6 g/L de biomassa e atividade específica de 3,12 U/mgproteína em meio Terrific Broth (TB). Melhorias consideráveis no cultivo em batelada alimentada (DO-stat) foram observadas com 17,5 g/L de biomassa e atividade específica de 6,43 U/ mgproteína no mesmo meio de cultivo. Utilizando o meio M9 modificado, a atividade específica chegou a 9,14 U/ mgproteína. Como resultado, a investigação traz uma nova visão para o desenvolvimento de transglutaminase para a indústria de alimentos e biotecnológica.

Transglutaminases are enzymes widely used in various industrial processes due to their protein cross-linking properties, mainly in the food industry in meat processing, cheese and other dairy products, bakery and edible film production. In the pharmaceutical area, it has been used in PEGylation reactions, production of antibody-drug conjugates, tissue engineering and regenerative medicine. Transglutaminases can also be an alternative to traditional chemical treatments in the processing of wool and leather. However, the extremely high costs of obtaining transglutaminase from animal sources have boosted research in the search for new sources of this enzyme. In these cases, efforts have been focused on the production of transglutaminase by microorganisms, which may have an even wider scope of use, due to the specific characteristics of microbial transglutaminase (mTGase). This enzyme, since its discovery, has been produced for industrial applications by the traditional fermentation process using the bacterium Streptomyces mobaraensis. Bacillus transglutaminase (bTGase), discovered more recently, appears to be a promising alternative to the production of TGase. Previous studies have shown that, compared to the commercial transglutaminase of Streptomyces mobaraense, bTGase is more stable over a wide range of pH and temperature, however, to date, few studies have been done to produce or improve Bacillus transglutaminase yields. For this reason, the objectives of this work were to clone and express the gene that encodes the TGase of Bacillus amyloliquefaciens in E. coli, obtaining the protein in its soluble and active form and to study its production in a bioreactor. For this purpose, a bicistronic plasmid was constructed containing the B. amyloliquefaciens transglutaminase gene fused to the Streptomyces caniferus prodomain to express the enzyme as an inactive zymogen. In addition, the 3C protease gene was cloned to activate the enzyme, avoiding the need to remove the product in vitro. The protein was then purified using a single step purification protocol and identified by mass spectrometry. The activity of the recombinant bTGase was investigated by cross-linking assays of bovine serum albumin and by fluorescence, showing a specific activity of 37 mU/mg protein when the recombinant cells were cultured in an orbital shaker. In order to improve the production of transglutaminase, cultivation strategies in batch and fed batch (DO-stat) were studied. After 30 h of batch cultivation, 6 g/L of biomass and specific activity of 3.12 U/mgprotein were obtained in Terrific Broth (TB) medium. 10 Considerable improvements in fed batch cultivation (DO-stat) were observed with 17.5 g/L of biomass and specific activity of 6.43 U/mgprotein in the same culture medium. Using the modified M9 medium, the specific activity reached 9.14 U/mgprotein. As a result, the research brings a new vision for the development of transglutaminase for the food and biotechnology industry.