Estabelecimento de linhagem de glioblastoma humano resistente ao quimioterápico temozolomida

Abstract

A reincidência tumoral está geralmente associada a resistência ao tratamento quimioterápico, onde estão envolvidas respostas adaptativas, alterações genéticas surgidas durante o tratamento, aumento da expressão do alvo terapêutico, ativação de vias alternativas de sinalização e vários outros mecanismos ainda desconhecidos. Linhagens de células tumorais resistentes são desenvolvidas in vitro para investigar e entender os potencias mecanismos de reincidência tumoral. Entretanto, a grande maioria desses modelos não se assemelham as condições clínicas durante a quimioterapia. O presente estudo visa estabelecer um protocolo experimental de resistência tumoral ao Temozolomida (TMZ), onde linhagem de célula glioblastoma U87-MG foram exposta um regime de tratamento similar ao regime clinico padrão com TMZ, na tentativa de obter um modelo in vitro de quimio-resistência clinicamente relevante. As células foram expostas ao TMZ em duas fases. Na primeira fase as células foram cultivadas com 18μM de TMZ cada 48h por um período de 22 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao fármaco. Já na segunda fase do tratamento, as células foram expostas diariamente a 25 μM de TMZ durante 5 dias, seguido de 4 semanas sem exposição ao TMZ. As células controles seguiram o mesmo regime de exposição, mas foram cultivadas com DMSO 0,5%. A resistência das células foi testada tratando-as com concentrações crescentes de TMZ por 72h. A quantidade de células após tratamento foi mensurada através do ensaio do SRB. Comparando as células cultivadas com TMZ e DMSO, observamos que não há diferenças significativas no nível de resistência das células ao quimioterápico. Porém diferenças morfológicas, assim como presenças de vesículas extracelulares, foram observadas nas células previamente expostas ao TMZ, o que sugere provável reposta adaptativa das células ao quimioterápico.

Tumor recurrence is usually associated with resistance to chemotherapy and probably caused by adaptative responses, genetic alterations developed during treatment, increase in the expression of therapeutic targets, activation of alternative signaling pathways and other unknown mechanisms. Chemoresistant cell lineages are developed in vitro as models to investigate and understand the potential mechanisms behind tumor recurrence. However, the majority of these models do not resemble to conditions experienced by patients during chemotherapy. The goal of this work is to develop an in vitro protocol of clinically relevant tumor resistance to Temozolomida (TMZ). The glioblastoma cell lineage U87-MG was exposed to a regime of treatment similar to the clinical standard regime with TMZ. Cells were exposed to TMZ in two phases. In the first phase, the cells were exposed to 18μM TMZ every 48h for 22 days, followed by 4 weeks without treatment. In the second phase, cells were daily exposed to 25 μM TMZ during 5 days, followed by 4 weeks without treatment. Control cells followed the same protocol of exposition, but were cultivated with DMSO 0,5%. The chemoresistance were tested by treating the exposed cells with increasing concentrations of TMZ for 72h. With SRB assay, we measured the quantity of cells after treatment. Comparing the cells cultivated with TMZ and DMSO, we observed no significant differences in the TMZresistance level between the cells. However, we observed morphological changes and presence of extracellular vesicles in the cells previously exposed to TMZ, indicating an adaptative response of these cells to the drug.