Desenvolvimento e validação de ensaio de RT-qPCR multiplex para detecção e diferenciação dos subtipos do vírus influenza A (H1/H3, N1/N2) circulantes em suínos no Brasil

Abstract

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral – H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral – N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/μL, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.

Influenza is an acute viral respiratory disease that affects several species of birds and mammals, including humans. The disease in pigs is caused by influenza A virus (IAV), which may has a significant economic impact on the affected swine herds, posing a threat to the human population due to its pandemic and zoonotic potential. Although the prevalent virus subtypes in swine herds worldwide are H1N1, H1N2 and H3N2, these are genetically and antigenically distinct, according to the geographic region of origin. Recent studies with IAV isolates from swine confirmed that the viral lineages detected in Brazil are restricted to the Brazilian territory, and no similar viruses were found in swine from other countries. In this way, a rapid diagnostic test, able to detect and differentiate the IAV subtype in pigs is important for the monitoring and control of the infection in swine herds. In addition, in Brazil there are no rapid tests commercially available, such as RT-qPCR, to subtype IAV in swine clinical samples. This study aimed to develop and validate two multiplex RT-qPCR assays (one for viral hemagglutinin – H1pdm, H1hu, H3; and another for viral neuraminidase – N1pdm, N1hu, N2) for the detection and differentiation H1N1, H1N2 and H3N2 IAV subtypes circulating in swine in Brazil. The analytical specificity of the technique was 100%, identifying the correct viral subtype and lineage in 85 IAVs previously characterized by genomic sequencing. The assay presented 100% of diagnostic specificity in 50 negative samples for IAV and positive for other swine pathogens. The limit of detection of the RT-qPCR ranged from 5.09x103 to 5.09x101 copies of viral RNA/μL, according to the gene evaluated. Afterwards, 73 swine clinical samples positive for IAV by RT-PCR (matrix gene) were tested. The multiplex RT-qPCR identified the viral subtype and lineage in 74% of the clinical samples analyzed, which the human-origin H3N2 (46.3%) subtype was the most detected, followed by the pandemic-origin H1N1 (33.3%), human-origin H1N2 (11.1%) and HxN1pdm (3.7%). In addition, co-infections (3.7%) and reassortant viruses (1.9%) were detected. Therefore, the multiplex RT-qPCR assay developed and validated in this study showed to be a rapid, very sensitive and specific method for IAV subtyping and lineages identification in swine samples. The technique described is cost-effective when compared to other methods, such as genomic sequencing, and once implemented in diagnostic laboratories, may provide information on the prevalence of viral subtypes in pigs, contributing to the monitoring and surveillance of influenza in swine herds.