Estudo da resposta in vitro a tratamentos quimioterápicos em linhagens tumorais a partir de colônias originadas de células únicas

Abstract

A sensibilidade in vitro a terapias antineoplásicas correlaciona-se pouco com a eficácia clínica em pacientes oncológicos, devido à sobrevivência de uma parcela ínfima de células tumorais resistentes que, eventualmente, levam a recorrência. Análises de célula-única, portanto, podem ser determinantes para a compreensão da resistência. Não é conhecido se as subpopulações resistentes são provenientes da seleção de uma única população clonal da massa tumoral ou se são compostas por variadas subpopulações, que compartilham uma ancestralidade, mas apresentam diferentes graus de resistência. Assim, o objetivo do trabalho é analisar o perfil de resposta clonal in vitro a quimioterápicos em linhagens tumorais, avaliando a heterogeneidade do efeito destes a partir de colônias originadas de células únicas. Células das linhagens U343 e U251 foram fotografadas diariamente até a formação de colônias compostas por 1 a 16 células ou, mantidas em cultura pelo tempo médio correspondente à formação de colônias de 50 células, calculado a partir de dados de Population Doubling (PD). Colônias formadas foram fotografadas e, em seguida, tratadas por 3 e 5 dias com Temozolomina (TMZ) e drogas adjuvantes (Mebendazol – MBZ, Vimblastina – VBL, Paclitaxel – PTX, Lomustina – CCNU e Cisplatina – CPT) nas suas doses plasmáticas Após os tratamentos, as colônias foram fotografadas regularmente até o limite máximo do campo de captação da imagem. Dados morfométricos das colônias foram obtidos pelo programa ImageProPlus para a análise da área, do número de células e da densidade das colônias ao longo do tempo. Foi registrado a seleção de sub-regiões celulares resistentes, com taxas de crescimento distintas, dentro de colônias originadas de células únicas, principalmente após tratamento com VBL e MBZ: esse evento foi denominado de resistência subclonal. Todas as drogas testadas em U251 apresentaram a ocorrência de resistência subclonal, exceto PTX, que desencadeou morte celular em todas colônias monitoradas. Em U343, a maioria das colônias proliferativas eram homogeneamente resistentes, embora tenham sido observados dois casos de resistência subclonal dentre seis colônias resistentes a VBL. Como conclusão, acreditava-se que uma colônia gerada a partir de célula única seria composta por células fenotípica e genotipicamente idênticas entre si e assim, responderia de forma homogênea aos quimioterápicos. No entanto, foi observado que, dentro de uma mesma colônia, a resposta à quimioterápicos também pode ser heterogênea. Os dados reforçam que, mesmo dentre clones, a resposta de células-únicas pode ser o ponto decisivo para o reestabelecimento do tumor. Como perspectiva, pretende-se automatizar a contagem das células, por meio de marcadores fluorescentes, para uma análise mais detalhada da origem dos eventos de resistência subclonal.