Biopsia da mucosa retal e terceira pálpebra de ovinos e otimizaçao do protocolo de imuno-histoquímica para diagnóstico de PrPsc em ruminantes.

Abstract

As encefalopatias espongiformes transmissíveis (EETs), também conhecidas como doenças do príon, ocorrem tanto nos animais como no homem, são responsáveis por doenças transmissíveis e hereditárias e provocam lesões degenerativas no cérebro. A presença de uma forma anormal da proteína (PrPsc) no tecido encefálico e linforreticular é característica peculiar das EETs. Essa proteína é altamente insolúvel e resistente à degradação por proteases e se deposita eventualmente sob forma de placas amilóides na substância cinzenta. Tais placas provocam a morte maciça de neurônios e células gliais, causando vacuolização intensa no tecido afetado. Este trabalho consistiu na otimização da técnica de imuno-histoquímica para proteína priônica no tecido nervoso e no tecido linforreticular, como método diagnóstico de EETs em bovinos, ovinos e caprinos. Além disso, verificou-se a eficiência da utilização de folículos linfóides coletados por biopsia de terceira pálpebra e mucosa retal para o diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos. Além disso, verificou-se a eficiência da utilização de folículos linfóides coletados por biopsia de terceira pálpebra e mucosa retal para o diagnóstico de scrapie em ovinos e caprinos. Entre janeiro de 2005 e janeiro de 2008 foram realizados exames de imuno-histoquímica e coloração por hematoxilina-eosina em amostras de tecidos de 5571 ruminantes (4829 bovinos, 1 bubalino, 708 ovinos e 33 caprinos) obtidas em necropsias, biopsias e materiais enviados para diagnóstico em formalina 10% ou em blocos de parafina. Os anticorpos monoclonais anti-príon F89/160.1.5 e F99/97.6.1 foram utilizados na técnica de imuno-histoquímica. Todas as amostras de bovinos e a do bubalino analisadas foram negativas para PrPSc. Entre os 741 ovinos e caprinos pesquisados, foram diagnosticados 81 animais positivos, 16 suspeitos e, em 100 animais, o material foi insuficiente para o diagnóstico. Foram realizadas cinco repetições da imuno-histoquímica para cada amostra positiva para PrPSc. O diagnóstico por imuno-histoquímica no tecido linforreticular foi considerado positivo quando o material apresentava um número de no mínimo quatro folículos linfóides, com centros germinativos. Este trabalho inclui o primeiro diagnóstico positivo de scrapie na espécie caprina no Brasil, com marcação imuno-histoquímica nas tonsilas, terceira pálpebra e linfonodo. A marcação pela imuno-histoquímica em quatro ovinos da raça Santa Inês, todos com diagnóstico positivo nas tonsilas e linfonodos e um deles também com depósito de PrPSc na terceira pálpebra, surge como primeiro diagnóstico da doença nessa raça no Brasil. Os resultados considerados suspeitos ou insuficientes observados nas amostras de biopsias ou enviadas por terceiros indicam que há ajustes a serem estudados, especialmente quanto à coleta das amostras. O envio de material de vários órgãos linfóides possibilitaria a confirmação da presença ou não do agente em pelo menos dois deles, diminuindo o número de casos considerados suspeitos e o risco de falsos positivos. O envio de amostras de biopsia de tonsila, terceira pálpebra e mucosa retal, conjuntamente, reduziria o número de casos suspeitos e eliminaria grande parte, senão a totalidade dos casos com material insuficiente para diagnóstico.

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), also known as prion diseases, occur in animals and humans and are responsible for transmissible and inherited disorders that cause fatal degenerations of the brain. A peculiar characteristic of TSEs is the conversion of a host-encoded glycoprotein termed prion protein (PrP), from a normal cellular form, PrPC, to an abnormally folded isoform, PrPSc, present in the nervous and lymphoreticular tissues. The prion protein PrPSc is highly insoluble and resistant to the proteases degradation, eventually leading its accumulation, forming amyloid protein plates deposition in the brain gray substance. These plates cause massive death of neurons and glial cells, producing intense vacuolation in the affected tissue. In this work, the immunohistochemical procedures were optimizated for prion protein in nervous and lymphoreticular tissues to provide diagnosis of TSEs in bovine, sheep and goat, and also to verify the efficiency of lymphoid follicles from third eyelid and rectal mucosa biopsies for the scrapie diagnosis in sheep and goats. Between January, 2005 and January, 2008 immunohistochemistry examinations and hematoxylin-eosin staining were accomplished in tissue samples from 5571 ruminants (4829 bovines, 1 water buffalo, 708 sheep and 33 goats), obtained from necropsies and biopsies, and samples of 10% formalin-fixed or paraffin embedded tissues submitted by other laboratories. The monoclonal antibodies anti-PrP F89/160.1.5 and F99/97.6.1 were used in the immunohistochemical procedures. All the samples from cattle and the water buffalo analyzed were negative to PrPSc. Among the 741 sheep and goats, there were 81 positive and 16 suspect samples, and 100 of them were insufficient to test. Five immunohistochemical repetitions were performed for each positive PrPSc sample. The immunohistochemistry diagnosis in the lymphoreticular tissues was considered positive when the material presented at least four lymphoid follicles with germinal centers. This work includes the first positive case in goats in Brazil (through immunohistochemical labelling in tonsils, third eyelid and lymph node) and the first four cases in Santa Inês sheep, by the same technique. The results considered as suspect or of insufficient sample indicate that some aspects associated with sample collection need further adjustment. The submission of samples from several lymphoid organs would probably make possible the confirmation or not of the agent presence in at least two of them, reducing the number of suspect and false positive cases. Simultaneous submission of biopsy samples from tonsil, third eyelid and rectal mucosa together could reduce the number of suspicious cases, besides of eliminating great part or even the totally of the insufficient samples.