Influência das proteínas XIAP e Survivina na resistência de Gliomas

Abstract

Glioblastomas (GBM) são tumores de difícil tratamento pela alta resistência a quimioterápicos. Entre os GBMs a presença de células tronco tumorais (CTT) foi associado a um pior prognóstico para os pacientes, indicando que essas células podem contribuir para resistência aos tratamentos. Além disso, proteínas como XIAP e survivina (inibidoras de apoptose) estão altamente expressas em GBMs e, devido a sua capacidade de inibir caspases, podem participar de mecanismos de resistência a apoptose. Nesse trabalho foi estudado o silenciamento estável de XIAP ou survivina e seus efeitos na sensibilização de GBMs U87-MG a fármacos. Para isso, utilizou-se RNAs de interferência short hairpin e vetores lentivirais para o silenciamento estável de XIAP ou survivina combinados a diversos fármacos. Entre os fármacos testados, doxorrubicina (doxo 1 μM) e vincristina (vinc) (100 nM) apresentaram os melhores resultados na sensibilização dos GBMs silenciados através da indução de apoptose e senescência. Doxo elevou a expressão das proteínas p53 e H2Ax, indicando dano ao DNA de forma acentuada nas linhagens silenciadas. Vinc apresentou indução de vários tipos de morte, com taxas de apoptose, necrose e alterações no aspecto nuclear que indicaram catástrofe mitótica. O efeito crônico dos tratamentos em 48 horas com doxo, temozolamida e vinc foi avaliado em ensaio clonogênico sem que as diferenças de sensibilização fossem mantidas. Com isso, sugere-se que nas células silenciadas foram selecionados mecanismos de resistência após os tratamentos. A formação de tumor-esferas nas culturas de U87-MG, um indicativo da presença de CTTs, analisada após cinco dias de tratamento com doses reduzidas de doxo e tmz mostrou que doxo 1 nM selecionou as CTT e induziu senescência nas células diferenciadas, enquanto que doxo 10 nM e tmz 5 μM reduziram o número de CTTs. Esse estudo mostrou que a inibição de XIAP e survivina sensibiliza GBMs a determinados fármacos principalmente através da indução de apoptose e senescência pela sinalização de p53. A avaliação do efeito em longo prazo do tratamento agudo com os fármacos estudados deve ser considerada como indicativo de que células silenciadas para XIAP e survivina podem desenvolver mecanismos que revertem o efeito do silenciamento. Além disso, dependendo da dose, doxo pode interferir na participação de CTTs na resistência de GBMs.

Glioblastomas (GBM) are characterized by high resistance to chemotherapy and difficult treatment. The cancer steam cells in GBMs were associated to poor prognosis for patient, and may contribute to enhanced resistance. Moreover, inhibitors of apoptosis proteins as XIAP and survivin are high expressed in GBM and due to their ability to caspase inhibition can be involved in apoptosis resistance mechanisms. In this work we study the stable silencement of XIAP or survivin and its effects in U87-MG sensitization to chemotherapy drugs. For this, short hairpin RNA delivery through lentiviral vectors were used to stable knocking down XIAP or survivin combined with drugs. Among the drugs tested, XIAP KD cells were more sensitive to doxorubicin (doxo) 1 μM and vincristine (vinc) 100 nM when compared to WT or control KD cells, presenting more apoptosis and senescence induction. This suggests that KD of XIAP sensitizes glioma cells to specific drugs. Doxo enhanced expression of activated proteins p53 and H2Ax, indicating enhanced DNA damage in KD cells compared to WT cells. Vinc induced diverse kind of death in KD cells, with apoptosis, necrosis and significant changes in nuclear appearance as a clue of mitotic catastrophe. The chronic effect after 48 hours treatments of temozolomide, doxo and vinc evaluated by clonogenic assay did not present the sensitization due to XIAP KD. These suggest a selection of resistance mechanism after treatments in KD cells. The tumor-spheres formation in U87-MG cultures, an indicative of CSC, was analyzed after 5 days treatments with low dosis of doxo and tmz. Doxo 1 nM selects CSC and induces senescence in differentiated cells. Doxo 10 nM and tmz 5 μM reduced the quantity of CSC. The results show XIAP and survivin KD sensitizes GBMs to some drugs, mainly by apoptosis and senescence by p53 signaling. The long term analysis of acute treatment should be considered as indicative that KD cells may develop reversive mechanisms to the combined effect of silencing XIAP and treating with chemotherapic drugs. Moreover, depending of the dosis, doxo can affect CSC participation on GBM resistance.