Seleção de genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras

Abstract

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido.

Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.