Modelagem molecular das δ-endotoxinas do Bacillus thuringiensis

Abstract

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria Gram-positiva entomotóxica usada no controle de insetos-praga e vetores de doenças há mais de 60 anos. Desde a introdução das plantas cultivadas expressando genes de Bt, ficou demonstrado que cultivares-Bt constituem uma importante ferramenta no aumento da produtividade e diminuição no uso de pesticidas químicos. O sucesso do Bt advém da produção das δ-endotoxinas (Cry). Estas toxinas compartilham um mecanismo de ação semelhante, com pelo menos, alguns aspectos em comum. A atividade das Cry é baseada nas clivagens N e C-terminais, ligação a receptores (i.e. caderinas) e mudanças conformacionais. O objetivo deste trabalho foi estudar aspectos estruturais das δ-endotoxinas Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 e Cry1Ia12 usando ferramentas de modelagem molecular por homologia, dinâmica molecular (DM) e docking molecular. Oito toxinas Cry e duas caderinas (CAD) foram modeladas. Quatro toxinas (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa e Cry8Ea1) foram usadas para construir 8 sistemas que foram submetidos a simulações de DM de 50 ns utilizando o pacote GROMACS e o campo de força GROMOS96 43a1. As Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 e suas 3 variantes foram comparadas a fim de estabelecer as relações entre as diferenças estruturais e as mudanças na toxicidade. As caderinas, Cry1Ab e Cry1Ac foram usadas nos cálculos de docking molecular. Os resíduos das Cry1A com RMSF alto são os mesmos identificados experimentalmente como sítios de reconhecimento/ligação aos receptores ou desempenham um papel na dinâmica de interação. Os dados mostraram que as flexibilidades global e local das Cry estudadas aumentaram nos sistemas sem a α-1 e isto pode estar relacionado com o mecanismo de ação. Este efeito se propaga por toda a superfície a não apenas na porção N-terminal, sugerindo o início de um processo de transição conformacional. Na Cry1Ac, a ausência da α-1 promove alterações estruturais na alça 2 (ligação a receptores GPI). Algumas mutações das Cry8Ka e Cry1Ia12 estão próximas dos sítios de ligação e podem estar contribuindo para as alterações nas toxicidades. Os mapas de interfaces resultantes dos dockings moleculares corresponderam aos dados experimentais. Neste trabalho foi possível observar novos aspectos do mecanismo de ação das toxinas Cry e suas interações com caderinas.

Bacillus thuringiensis (Bt) is a Gram-positive entomotoxic bacterium widely used to control crop pests and disease vectors. Since the introduction of transgenic plants expressing Bt genes, it has been demonstrated that Bt-crops constitute an important tool in the increase of productivity and in the decrease of the use of chemical pesticides. Its success comes from the production of the δ-endotoxins (Cry). These toxins share a molecular mechanism of similar action or, at least, some common aspects. Activity of Cry proteins is due to N- or C-terminal cleavages, binding to at least one membrane receptor (e.g. cadherins) and conformational changes. The aim of this work was to study structural aspects of Cry1Aa, Cry1Ab, Cry1Ac, Cry3Aa, Cry8Ea1, Cry8Ka1, Cry8Ka5 and Cry1Ia12 δ-endotoxins, using homology modeling, molecular dynamics (MD) and molecular docking. Eight Cry toxins and two cadherins (CAD) were modeled. Four toxins (Cry1Aa, Cry1Ac, Cry3Aa and Cry8Ea1) were used to construct eight systems (whole Cry toxins and α-1 removed proteins (Δα1)). Cry8Ka1, Cry8Ka5, Cry1Ia12 and their three variants were compared to analyze the contributions of each mutation. The cadherins and Cry1Ab and Cry1Ac were used on docking calculations. The Cry1A residues with high flexibility are the same identified as recognition/binding sites (apex of domain II and domain-II/IIIinterface) or to play a role on its dynamic. The data show that the global and local flexibilities of Cry toxins studied was increased by helix α-1withdrawal (Δα1) and it is closely related with the mode of action. This effect propagates on the surface and not only on the N-termini suggesting a complex process of conformational transition. Regarding Cry1Ac, the absence of helix α-1 triggers structural changes on loop2, which is related to binding GPI-receptors. Some Cry8Ka5 and Cry1Ia12 mutations are in the neighborhood of receptor-binding sites and this fact may imply alterations on binding affinity. It was possible to obtain a map of Cry/CAD interface by docking studies. Therefore, this work was able to obtain molecular level insights into the Cry activation mechanism and its interaction with CAD.