TCC Biomedicina

Relevância da ruptura da homeostase redox cardiovascular induzida por anemia hemolítica : papel protetor do tratamento com melatonina

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

Relevância da ruptura da homeostase redox cardiovascular induzida por anemia hemolítica : papel protetor do tratamento com melatonina Oliveira, Vitória Rosa de As anemias compreendem um grupo de doenças com múltiplos agentes etiológicos, diferentes manifestações clínicas e variados desfechos. Trata-se de um relevante problema epidemiológico de saúde pública em escala global. Dentre os aspectos relacionados à sintomatologia das anemias, destacam-se aqueles associados à redução do aporte de oxigênio aos tecidos, cujas manifestações variam conforme a gravidade do quadro clínico. Esses sintomas podem incluir desde fadiga leve até comprometimento funcional de órgãos vitais, como o coração, em casos mais graves. Nesse contexto, encontram-se as anemias hemolíticas que são caracterizadas pela destruição precoce e acentuada dos eritrócitos circulantes. A fenilhidrazina é um agente químico amplamente reconhecido por sua capacidade de induzir hemólise através da geração de estresse oxidativo, explorando a vulnerabilidade dos eritrócitos a espécies reativas de oxigênio (ROS, do inglês Reactive Oxygen Species) e outras moléculas de radicais livres acentuadamente produzidas nesse contexto. A lise eritrocitária maciça, por sua vez, potencializa o desequilíbrio na homeostase redox sistêmica, tanto pela liberação de produtos da degradação eritrocitária quanto pela sobrecarga funcional exigida de diferentes órgãos e sistemas em um ambiente com baixa disponibilidade de oxigênio e alta demanda metabólica. Diante disso, torna-se relevante a investigação de compostos ou moléculas que ofereçam efeito protetor e que possibilitem a minimização de danos causados em quadros hemolíticos. A melatonina, nesse cenário, destaca-se por suas conhecidas propriedades antioxidantes e imunomoduladoras, bem como por sua capacidade de atuar em diferentes células e tecidos. Portanto, o presente estudo buscou investigar o impacto do pré-tratamento com melatonina em um contexto hemolítico agudo. Para isso, foram utilizados 28 ratos Wistar machos aleatoriamente distribuídos em quatro grupos experimentais, a saber: grupo não anêmico e não tratado (CTRL); grupo anêmico e não tratado (PHZ); grupo não anêmico e tratado com melatonina (MEL); grupo anêmico e tratado com melatonina (MEL+PHZ). A partir do sangue dos referidos animais, foram realizadas análises hematológicas e a medição do nível sérico de algumas enzimas, enquanto o baço e o ventrículo esquerdo foram utilizados para medidas bioquímicas de estresse oxidativo e análises morfométricas. Os resultados demonstraram que a fenilhidrazina reduz significativamente os níveis eritrocitários, e que a melatonina parece não atuar diretamente sobre esses parâmetros. Por outro lado, a administração de melatonina promoveu redução nos níveis de ROS no ventrículo esquerdo do grupo MEL+PHZ (p < 0,05), bem como promoveu a diminuição dos níveis séricos da enzima aspartato aminotransferase (AST) no mesmo grupo, indicando possível efeito atenuante frente aos danos oxidativos em tecidos como o coração. No baço, apesar da melatonina não ter revertido ou atenuado efetivamente os danos no tecido, os níveis de ROS no grupo MEL+PHZ não apresentaram diferença estatística em relação ao grupo MEL. Paralelamente, os dados também indicaram que a melatonina exerceu impacto significativo sobre o nível de neutrófilos segmentados em animais do grupo MEL, levando a redução do número dessas células no referido grupo quando comparado ao grupo CTRL. Assim, o presente estudo oferece uma visão abrangente sobre os efeitos da fenilhidrazina nos índices hematológicos, além de permitir avaliar a ação da melatonina sobre parâmetros de estresse oxidativo no baço e no ventrículo esquerdo dos animais dos diferentes grupos experimentais.; Anemias comprise a group of diseases with multiple etiological agents, different clinical manifestations, and varied outcomes. This is a relevant epidemiological public health problem on a global scale. Among the aspects related to the symptomatology of anemias, those associated with the reduced oxygen supply to tissues stand out, with manifestations varying according to the severity of the clinical condition. These symptoms may range from mild fatigue to functional impairment of vital organs, such as the heart, in more severe cases. In this context are hemolytic anemias, which are characterized by the premature and accentuated destruction of circulating erythrocytes. Phenylhydrazine is a chemical agent widely recognized for its ability to induce hemolysis through the generation of oxidative stress, exploiting the vulnerability of red blood cells to reactive oxygen species (ROS) and other free radical molecules markedly produced in this context. Massive erythrocyte lysis, in turn, enhances the imbalance in systemic redox homeostasis, both due to the release of erythrocyte degradation products and to the functional overload required of different organs and systems in an environment with low oxygen availability and high metabolic demand. Given this, the investigation of compounds or molecules that offer a protective effect and allow the minimization of damage caused in hemolytic conditions becomes relevant. Melatonin, in this scenario, stands out for its well-known antioxidant and immunomodulatory properties, as well as for its ability to act on different cells and tissues. Therefore, the present study aimed to investigate the impact of melatonin pretreatment in an acute hemolytic context. To this end, 28 male Wistar rats were randomly distributed into four experimental groups, namely: non-anemic and untreated group (CTRL); anemic and untreated group (PHZ); non-anemic group treated with melatonin (MEL); anemic group treated with melatonin (MEL+PHZ). From the blood of these animals, hematological analyses and serum levels of some enzymes were performed, while the spleen and left ventricle were used for biochemical measurements of oxidative stress and morphometric analyses. The results showed that phenylhydrazine significantly impacts erythrocyte levels, reducing them, and that melatonin does not appear to act directly on these parameters. On the other hand, melatonin administration promoted a reduction in reactive oxygen species levels in the left ventricle of the MEL+PHZ group (p < 0.05), as well as a decrease in serum levels of the enzyme aspartate aminotransferase in the same group, indicating a possible attenuating effect against oxidative damage in tissues such as the heart. In the spleen, although melatonin did not effectively reverse or attenuate tissue damage, ROS levels in the MEL+PHZ group did not show a statistical difference compared to the MEL group. Additionally, data also indicated that melatonin had a significant impact on the level of segmented neutrophils in animals from the MEL group, leading to a reduction in the number of these cells in this group compared to the CTRL group. Thus, the present study offers a comprehensive overview of the effects of phenylhydrazine on hematological indices and allows the evaluation of melatonin’s action on oxidative stress parameters in the spleen and left ventricle across the different experimental groups.

Avaliação do protocolo de isolamento de vesículas extracelulares salivares quanto à recuperação de miRNAs para estudos de biomarcadores no câncer de cabeça e pescoço

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

Avaliação do protocolo de isolamento de vesículas extracelulares salivares quanto à recuperação de miRNAs para estudos de biomarcadores no câncer de cabeça e pescoço Oliveira, Aline Rodrigues Parra de As vesículas extracelulares (VEs) presentes na saliva têm se destacado como fontes promissoras de biomarcadores moleculares de caráter não invasivo, especialmente microRNAs (miRNAs), reconhecidos por sua relevância regulatória em vias associadas ao câncer. No entanto, desafios metodológicos relacionados ao isolamento das VEs e à recuperação de miRNAs podem impactar diretamente a sensibilidade e a reprodutibilidade das análises. Este estudo teve como objetivo otimizar um protocolo de isolamento de VEs salivares baseado em ultracentrifugação empregando um cushion duplo de OptiPrep™ (2C-UC) e avaliar sua eficiência na recuperação de miRNAs associados às vesículas salivares. A otimização envolveu ajustes sucessivos nas características do tampão, na densidade do cushion de OptiPrep, no tempo de ultracentrifugação, além da avaliação de etapas complementares, como ultrafiltração e ultracentrifugação de lavagem. As frações de coleta das VEs foram caracterizadas quanto à concentração e distribuição de tamanho por NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) e DLS (dynamic light scattering), bem como pela presença de marcadores clássicos de VEs e lipoproteínas por Western Blot. A densidade das frações de coleta foi determinada por refratometria, e o conteúdo proteico das frações foi quantificado pelo método de Bradford. Após testes comparativos, definiu-se como procedimento final o protocolo de 2C-UC com tampão de diluição baseado em HEPES e lactose, cushion superior de 10% de Optiprep e 4h de ultracentrifugação, seguido de uma etapa de lavagem mais curta de 70 minutos para retirada do Optiprep e outros contaminantes. O protocolo desenvolvido foi comparado a dois métodos amplamente utilizados na literatura, ultracentrifugação diferencial (UC1) e ultracentrifugação diferencial com etapa de lavagem (UC2), permitindo avaliar a eficiência relativa entre os protocolos. Os resultados sugerem que o protocolo 2C-UC apresentou maior recuperação total de VEs, melhor separação de contaminantes e capacidade superior de recuperar VEs de menor diâmetro em comparação aos outros dois protocolos. A avaliação da recuperação de miRNAs associados às VEs demonstrou que, apesar das perdas inerentes ao processo, o protocolo 2C-UC permitiu a detecção consistente dos miRNAs selecionados (miR-205 e let-7a), com valores de CT dentro de faixas adequadas para análise quantitativa. O protocolo 2C-UC apresentou quantidade 23 vezes maior de miR-205 em comparação ao UC2, enquanto para o miR-let-7 ambos os protocolos mostraram valores semelhantes, o que pode sugerir a associação deste último miRNA com HDL contaminante. Em síntese, o protocolo de isolamento utilizando duplo cushion de Optiprep (2C-UC), seguido por ultracentrifugação de lavagem, desenvolvido e otimizado neste trabalho, permitiu recuperar quantidades significativamente maiores de miRNAs associados às vesículas salivares quando comparado a protocolos padrão de ultracentrifugação amplamente utilizados na literatura. A partir deste estudo, abre-se a possibilidade de refinar ainda mais o protocolo para a análise de outros miRNAs presentes na saliva, permitindo investigar seu perfil de expressão no contexto do câncer de cabeça e pescoço.; Extracellular vesicles (EVs) present in saliva have emerged as promising sources of non-invasive molecular biomarkers, especially microRNAs (miRNAs), which are widely recognized for their regulatory relevance in cancer-associated pathways. However, methodological challenges related to EV isolation and miRNA recovery may directly impact the sensitivity and reproducibility of the analyses. This study aimed to optimize a saliva EV isolation protocol based on ultracentrifugation using a double OptiPrep™ cushion (2C-UC) and to evaluate its efficiency in recovering miRNAs associated with salivary vesicles. The optimization involved successive adjustments to buffer composition, OptiPrep cushion density, ultracentrifugation time, and the evaluation of complementary steps such as ultrafiltration and washing ultracentrifugation. The EV collection fractions were characterized in terms of concentration and size distribution by NTA (Nanoparticle Tracking Analysis) and DLS (dynamic light scattering), as well as by the presence of classical EV and lipoprotein markers through Western Blot. The density of the collection fractions was determined by refractometry, and the protein content was quantified using the Bradford method. After comparative testing, the final procedure was defined as the 2C-UC protocol with a HEPES- and lactose-based dilution buffer, an upper 10% OptiPrep cushion, and 4 hours of ultracentrifugation, followed by a shorter 70-minute washing step to remove OptiPrep and other contaminants. The developed protocol was compared with two widely used methods in the literature—differential ultracentrifugation (UC1) and differential ultracentrifugation with a washing step (UC2)—allowing assessment of the relative efficiency between protocols. The results suggest that the 2C-UC protocol yielded greater overall EV recovery, improved contaminant separation, and superior ability to recover smaller-diameter EVs compared to the other two protocols.The evaluation of miRNA recovery associated with EVs showed that, despite the inherent losses of the process, the 2C-UC protocol enabled consistent detection of the selected miRNAs (miR-205 and let-7a), with CT values within appropriate ranges for quantitative analysis. The 2C-UC protocol yielded 23-fold higher amounts of miR-205 compared with UC2, while for miR-let-7 both protocols showed similar values, which may suggest association of the latter miRNA with contaminating HDL. In summary, the isolation protocol using a double OptiPrep cushion (2C-UC), followed by washing ultracentrifugation, developed and optimized in this study, enabled the recovery of significantly higher amounts of miRNAs associated with salivary vesicles compared to standard ultracentrifugation protocols widely used in the literature. From this study, the possibility emerges to further refine the protocol for the analysis of other miRNAs present in saliva, enabling investigation of their expression profile in the context of head and neck cancer.

Avaliação dos efeitos da melatonina na neurodegeneração pós-trauma cranioencefálico

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

Avaliação dos efeitos da melatonina na neurodegeneração pós-trauma cranioencefálico Herasinczuk, Gabriela Cabral Soares O trauma cranioencefálico (TCE) pode ser definido como qualquer lesão ao tecido cerebral decorrente de forças biomecânicas externas, podendo ser classificado em leve, moderado ou grave, sendo o TCE leve repetido (concussão) um dos tipos mais frequentes, especialmente associado a quedas, acidentes automotores, esportes de contato e situações de violência. Sua fisiopatologia envolve uma lesão primária inicial que desencadeia cascatas bioquímicas responsáveis pela lesão secundária, caracterizada por disfunção mitocondrial, desbalanço iônico, acúmulo de proteínas citotóxicas, liberação excessiva de espécies reativas de oxigênio e ativação de mecanismos de apoptose, contribuindo para uma neurodegeneração progressiva. A melatonina, amplamente reconhecida por suas propriedades antioxidantes, anti-inflamatórias e neuroprotetoras, tem sido investigada como possível terapia para atenuar esses processos. Nesse contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos neuroprotetores da melatonina em um modelo experimental de TCE em camundongos, analisando desfechos neuroquímicos, fisiológicos e motores pós-lesão. Para tal, foram utilizados camundongos da linhagem CF-1 distribuídos em quatro grupos experimentais (n=10 por grupo): CS (controle + salina), CM (controle + melatonina), TS (TCE + salina) e TM (TCE + melatonina). Os grupos submetidos ao trauma receberam três concussões com intervalos de 72 horas e, após 24 horas da última lesão, iniciaram tratamento com melatonina (10 mg/kg/dia) durante sete dias. Foram avaliados parâmetros comportamentais e motores, como peso corporal, força muscular e simetria motora, além de aspectos mitocondriais, incluindo potencial de membrana e fluxo de Ca²⁺, bem como imunoconteúdo de proteínas relacionadas ao estresse oxidativo. Os resultados demonstraram que o modelo empregado não foi capaz de gerar alterações significativas nos parâmetros avaliados, sugerindo que o protocolo adotado pode ter induzido um trauma de baixa intensidade. Da mesma forma, o tratamento com melatonina não promoveu modificações mensuráveis nesses desfechos, não apresentando efeito neuroprotetor detectável nas condições analisadas. Esses achados reforçam a necessidade de ajustes metodológicos em estudos futuros, visando modelos de trauma mais robustos e abordagens experimentais que permitam identificar alterações sutis associadas ao TCE e às possíveis ações da melatonina.; Traumatic brain injury (TBI) can be defined as any damage to brain tissue resulting from external biomechanical forces and can be classified as mild, moderate, or severe, with repeated mild TBI (concussion) being one of the most frequent types, especially associated with falls, motor vehicle accidents, contact sports, and violent events. Its pathophysiology involves an initial primary injury that triggers biochemical cascades responsible for secondary damage, characterized by mitochondrial dysfunction, ionic imbalance, accumulation of cytotoxic proteins, excessive release of reactive oxygen species, and activation of apoptotic mechanisms, all contributing to progressive neurodegeneration. Melatonin, widely recognized for its antioxidant, anti-inflammatory, and neuroprotective properties, has been investigated as a potential therapeutic approach to mitigate these processes. In this context, the present study aimed to evaluate the neuroprotective effects of melatonin in an experimental mouse model of TBI, analyzing post-injury neurochemical, physiological, and motor outcomes. For this purpose, CF-1 mice were allocated into four experimental groups (n=10 per group): CS (control + saline), CM (control + melatonin), TS (TBI + saline), and TM (TBI + melatonin). The trauma groups were subjected to three concussions at 72-hour intervals and, 24 hours after the last injury, began treatment with melatonin (10 mg/kg/day) for seven days. Behavioral and motor parameters such as body weight, muscle strength, and motor symmetry were assessed, as well as mitochondrial aspects including membrane potential and Ca²⁺ flux, along with the immunocontent of proteins related to oxidative stress. The results showed that the model employed did not induce significant changes in any of the evaluated parameters, suggesting that the protocol may have produced a low-intensity trauma. Likewise, melatonin treatment did not promote measurable modifications in these outcomes, exhibiting no detectable neuroprotective effect under the conditions tested. These findings reinforce the need for methodological adjustments in future studies, aiming for more robust trauma models and experimental approaches capable of identifying subtle alterations associated with TBI and the potential actions of melatonin.

Avaliação da proliferação de células H9c2 em resposta ao tratamento com o trastuzumabe

Wed, 01 Jan 2025 00:00:00 GMT

Avaliação da proliferação de células H9c2 em resposta ao tratamento com o trastuzumabe Casagrande, Guilherme Curi Aiub O presente trabalho investigou os efeitos do trastuzumabe, um anticorpo monoclonal amplamente utilizado no tratamento de tumores de mama HER2-positivos, sobre a proliferação e o ciclo celular da linhagem cardíaca H9c2, visando compreender sua aplicabilidade como modelo de estudo da cardiotoxicidade associada a terapias anti-HER2. Embora a toxicidade cardíaca seja uma das principais preocupações clínicas relacionadas ao uso do trastuzumabe, sobretudo pela participação central do receptor HER2/ErbB2 na homeostase, sobrevivência e reparo dos cardiomiócitos, a literatura aponta limitações estruturais relevantes do receptor em roedores, que apresentam baixa afinidade pela molécula terapêutica. Nesse contexto, a avaliação da linhagem H9c2, derivada de mioblastos cardíacos de rato e frequentemente utilizada em estudos cardiológicos, torna-se crucial para determinar se esse modelo é capaz de reproduzir mecanismos fisiopatológicos dependentes de HER2. No presente estudo, células H9c2 foram expostas a concentrações terapêuticas (0,5 μM e 1,5 μM) e supraterapêuticas (8 μM) de trastuzumabe, sendo analisadas por citometria de fluxo quanto à proliferação e distribuição das fases do ciclo celular. Os resultados demonstraram que apenas a concentração de 8 μM promoveu redução da proliferação, aumento da fração de células de baixa atividade proliferativa e indução de parada do ciclo celular em G0/G1, acompanhada de diminuição da fase S. Não foram observadas alterações significativas nas concentrações equivalentes às encontradas em pacientes, indicando que o fármaco não exerce efeitos detectáveis em H9c2 dentro da faixa farmacológica relevante. Esses achados reforçam que, apesar de sua ampla difusão em pesquisas cardiológicas, a linhagem H9c2 apresenta limitações substanciais para o estudo de mecanismos dependentes da interação direta entre trastuzumabe e HER2, uma vez que o receptor em roedores apresenta baixa ou nula afinidade pelo anticorpo. Assim, os efeitos celulares observados apenas em doses muito elevadas sugerem respostas inespecíficas ou off-target, e não um fenômeno fisiopatológico similar ao que ocorre no tecido cardíaco humano. Dessa forma, conclui-se que a H9c2, em sua forma não modificada, não constitui um modelo adequado para investigação de cardiotoxicidade dependente de HER2, sendo recomendada a utilização de modelos mais próximos da fisiologia humana, como cardiomiócitos humanos diferenciados, células transfectadas com HER2 humano ou modelos geneticamente humanizados. Esses sistemas poderão oferecer maior precisão na compreensão dos mecanismos cardiotóxicos associados às terapias anti-HER2 e contribuir para o desenvolvimento de estratégias que minimizem riscos cardíacos em pacientes oncológicos.; The present study investigated the effects of trastuzumab, a monoclonal antibody widely used in the treatment of HER2-positive breast tumors, on the proliferation and cell cycle of the cardiac-derived H9c2 cell line, with the aim of assessing its applicability as a model for studying cardiotoxicity associated with anti-HER2 therapies. Although cardiac toxicity is one of the major clinical concerns related to trastuzumab use—particularly due to the central role of the HER2/ErbB2 receptor in cardiomyocyte homeostasis, survival, and repair—the literature highlights relevant structural limitations of the receptor in rodents, which exhibit low affinity for the therapeutic molecule. In this context, evaluating the H9c2 line, derived from rat cardiac myoblasts and frequently used in cardiovascular research, is essential to determine whether this model can reproduce HER2-dependent pathophysiological mechanisms. In this study, H9c2 cells were exposed to therapeutic (0.5 μM and 1.5 μM) and supratherapeutic (8 μM) concentrations of trastuzumab and analyzed by flow cytometry for proliferation and cell-cycle phase distribution. The results showed that only the 8 μM concentration induced reduced proliferation, an increased fraction of low-proliferative cells, and cell-cycle arrest in G0/G1, accompanied by a decrease in S-phase. No significant alterations were observed at concentrations equivalent to those found in patients, indicating that the drug does not exert detectable effects on H9c2 cells within the clinically relevant pharmacological range. These findings reinforce that, despite its widespread use in cardiovascular research, the H9c2 cell line presents substantial limitations for studying mechanisms dependent on the direct interaction between trastuzumab and HER2, given that the rodent receptor displays low or absent affinity for the antibody. Thus, cellular effects observed only at very high concentrations suggest nonspecific or off-target responses rather than physiological phenomena comparable to those occurring in human cardiac tissue. Therefore, we conclude that unmodified H9c2 cells do not constitute an adequate model for investigating HER2-dependent cardiotoxicity. The use of models more closely aligned with human physiology—such as differentiated human cardiomyocytes, HER2-transfected cells, or genetically humanized models—is recommended. These systems may provide greater accuracy in elucidating the cardiotoxic mechanisms associated with anti-HER2 therapies and support the development of strategies that minimize cardiac risks in oncology patients.