Bioquímica
http://hdl.handle.net/10183/21
2024-03-28T15:16:29ZO sulfeto de hidrogênio altera a homeostase redox e energética e a dinâmica mitocondrial em estriado de ratos
http://hdl.handle.net/10183/274039
O sulfeto de hidrogênio altera a homeostase redox e energética e a dinâmica mitocondrial em estriado de ratos
Marcuzzo, Manuela Bianchin
A encefalopatia etilmalônica (EE) é uma doença neuromatabólica rara de caráter autossômico recessivo causada pela deficiência na proteína da encefalopatia etilmalônica 1 (ETHE1), a qual participa do catabolismo de aminoácidos sulfurados e, portanto, da detoxificação de sulfeto de hidrogênio (H2S). Devido à deficiência da ETHE1, a EE caracteriza-se bioquimicamente pelo acúmulo de metabólitos tóxicos em diferentes tecidos, incluindo o cérebro, como o sulfeto de hidrogênio e tiossulfato. Os pacientes apresentam sintomas neurológicos graves como leucoencefalopatia difusa, lesões na substância cinzenta do cérebro e alterações nos gânglios da base, cuja fisiopatologia não está totalmente estabelecida. Além disso, não existe tratamento eficaz para essa doença. Portanto, para elucidar os mecanismos patológicos da EE, investigamos os efeitos da administração intraestriatal de sulfeto no corpo estriado de ratos jovens. Ratos jovens foram anestesiados e receberam uma única injeção intraestriatal de sulfeto (2 e 4 μmol) com auxílio de estereotáxico e foram eutanasiados 30 min após a administração. O estriado foi então dissecado e usado para a determinação da homeostase redox, bioenergética e dinâmica mitocondrial. Nossos achados mostraram que a administração de 2 μmol de sulfeto diminuiu a atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH). Já na dose de 4 μmol, o sulfeto diminuiu as atividades da SOD, glutationa S-transferase e glutationa redutase, porém aumentou GPx. Os níveis de malondialdeído e glutationa reduzida não foram alterados pelo sulfeto em nenhuma das doses avaliadas. Em relação à atividade das enzimas do ciclo do ácido cítrico, o sulfeto, na dose de 2 μmol, aumentou a citrato sintase, porém não modificou as atividades da malato desidrogenase, isocitrato desidrogenase e succinato desidrogenase. Na dose de 4 μmol, o sulfeto apenas aumentou a atividade da succinato desidrogenase. Além disso, verificamos que apenas a atividade do complexo IV da cadeia respiratória mitocondrial foi alterada pela dose de 4 μmol de sulfeto. As atividades dos complexos I, II e II-III não foram significativamente alteradas. Também foi observado que o sulfeto, em 4 μmol, diminuiu a respiração mitocondrial na presença de piruvato, malato e glutamato, e succinato como substratos. Finalmente, avaliamos os efeitos do sulfeto sobre os níveis do fator nuclear eritróide 2 relacionado ao fator 2 (Nrf2) e de proteínas que participam da dinâmica mitocondrial (fusão e fissão). Observamos que a dose de 4 μmol de sulfeto diminuiu os níveis de Nrf2 e mitofusina 1, porém aumentou os níveis da proteína de atrofia óptica 1 (OPA1). Os níveis da proteína relacionada à dinamina 1 (DRP1) e do canal de ânion dependente de voltagem 1 (VDAC1) não foram alterados. Nossos dados mostram que o sulfeto causa estresse oxidativo e disfunção bioenergética e altera a dinâmica mitocondrial em estriado de ratos. Portanto, sugerimos que esses mecanismos contribuem, ao menos em parte, para a fisiopatologia do dano nos gânglios basais observado em pacientes com EE.; Ethylmalonic encephalopathy (EE) is a rare autosomal recessive neurometabolic disease caused by a deficiency in the ethylmalonic encephalopathy 1 (ETHE1) protein, which participates in the catabolism of sulfur amino acids and, therefore, in the detoxification of hydrogen sulfide (H2S). Due to the enzymatic deficiency, EE is biochemically characterized by the accumulation of toxic metabolites in different tissues, including the brain, such as hydrogen sulfide and thiosulfate. Patients present with severe neurological symptoms that include diffuse leukoencephalopathy, lesions in the gray matter, and changes in the basal ganglia, the pathophysiology of which has not been fully established. Furthermore, there is no effective treatment for this disease. Therefore, to elucidate the pathological mechanisms of EE, we investigated the effects of intrastriatal administration of sulfide in the striatum of young rats. Young rats were anesthetized and received a single intrastriatal injection of sulfide (2 or 4 μmol) in a stereotaxic device and were euthanized 30 min after administration. The striatum was then dissected and used to determine redox homeostasis, bioenergetics, and mitochondrial dynamics. Our findings showed that the administration of 2 μmol of sulfide decreased the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH). At a dose of 4 μmol, sulfide decreased the activities of SOD, glutathione S-transferase and glutathione reductase, but increased of GPx. However, malondialdehyde and reduced glutathione levels were not altered by sulfide at any of the doses evaluated. Regarding the activity of citric acid cycle enzymes, sulfide, at the dose of 2 μmol, increased citrate synthase, but did not modify the activities of malate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase, and succinate dehydrogenase. At the dose of 4 μmol, sulfide only increased succinate dehydrogenase activity. Furthermore, we found that only the activity of respiratory chain complex IV was altered by the dose of 4 μmol of sulfide. The activities of complexes I, II, and II-III were not significantly altered. It was also observed that sulfide, at 4 μmol, decreased mitochondrial respiration in the presence of pyruvate, malate and glutamate, as well as succinate as substrates. Finally, we evaluated the effects of sulfide on the levels of Nrf2 and proteins that participate in mitochondrial dynamics (fusion and fission). We observed that the dose of 4 μmol of sulfide decreased the levels of Nrf2 and mitofusin 1 but increased the levels of optic atrophy protein 1 (OPA1). Dynamin-related protein 1 (DRP1) and voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) levels were not altered. Our data show that sulfide causes oxidative stress and bioenergetic dysfunction and alters mitochondrial dynamics in rat striatum. Therefore, we suggest that these mechanisms contribute, at least in part, to the pathophysiology of basal ganglia damage observed in patients with EE.
2024-01-01T00:00:00ZPropriedades neurais das catequinas EGG e EGCG : efeito quelante de metais e genoproteção in vitro e neuroproteção in vivo no modelo de Parkinson
http://hdl.handle.net/10183/273879
Propriedades neurais das catequinas EGG e EGCG : efeito quelante de metais e genoproteção in vitro e neuroproteção in vivo no modelo de Parkinson
Abib, Renata Torres
O consumo do chá verde tem apresentado inúmeros benefícios à saúde humana, e estes efeitos têm sido atribuídos às catequinas (estruturas polifenólicas) que o constitui, especialmente à epicatequina galato (ECG) e à epigalocatequina galato (EGCG). A permeabilidade à barreira hemato-encefálica, o fácil acesso através da dieta e a baixa toxicidade das catequinas, apontam-nas como promissoras para prevenção e tratamento de doenças crônicas neurodegenerativas. Em função disso, esta tese visa à análise de catequinas em parâmetros in vitro (genoproteção e atividade mitocondrial) e in vivo no modelo de Parkinson. A fim de investigar a propriedade genoprotetora utilizamos ECG nas concentrações de 0,1, 1 e 10 μM em células astrogliais da linhagem C6 e concluímos que a ECG apresenta efeito tempo-dose-dependente, sendo genoprotetora em concentrações baixas e tempos curtos, e, embora não tenha ocorrido morte celular significativa, observou-se um efeito genotóxico quando em altas concentrações e tempos prolongados. Além disso, a ECG 0,1 e 1 μM foi capaz de proteger do dano ao DNA induzido por H₂O₂ – espécie reativa gerada principalmente pela mitocôndria. Sabendo do efeito neuroprotetor das catequinas, investigamos o efeito da EGCG in vitro e in vivo. Em frações ricas em mitocôndrias de encéfalos de ratos, a EGCG foi testada nas concentrações de 10, 50 e 100 μM durante 2 h na presença ou não de Cd²⁺ 200 μM – metal altamente tóxico - e concluímos que a EGCG não somente apresenta um efeito antioxidante importante, visto através da prevenção total da lipoperoxidação e da perda de viabilidade mitocondrial induzida por Cd²⁺, como apresenta efeito quelante equimolar sobre este metal. Entretanto, a EGCG não preveniu a oxidação da glutationa – importante defesa antioxidante do organismo - induzida por Cd²⁺, isto sugere que a EGCG esteja agindo através da remoção das espécies reativas geradas pelo metal e/ou pela sua complexação ao cádmio, e não via aumento da glutationa. Em modelo animal de Parkinson induzido por 6-OHDA, sugere-se que, a partir de dados preliminares, a EGCG tem efeito benéfico sobre a morte dos neurônios dopaminérgicos da substância negra, mas não sobre o comportamento motor. Estes achados sugerem que as catequinas em baixas concentrações - como as encontradas fisiologicamente (até 2 μM) - e em período relativamente curto - como as quais permanecem no organismo (até 8 h) após o consumo do chá, sejam benéficas em longo prazo.; Green tea consumption has shown numerous benefits to human health, and these effects have been attributed to catechins (polyphenolic structures) that constitute especially epicatechin gallate (ECG) and epigallocatechin gallate (EGCG). Their blood- brain barrier permeability, easy access through the diet and low toxicity of catechins, show them as promising molecules for prevention and treatment of chronic neurodegenerative disorders. The aim of this thesis is analyze catechins in vitro parameters (genoprotection and mitochondrial activity) and in vivo using Parkinson's disease model. In order to investigate the genoprotective effects, we used ECG 0.1, 1 and 10 μM in C6 astroglial cells and we concluded that ECG shows dose-time- dependent effects, being genoprotective at low concentrations and short times, and presenting genotoxic effect at high concentrations and prolonged periods, although didn’t occur significant cell death. Moreover, ECG 0.1 μM was able to protect DNA damage induced by H₂O₂ - reactive specie generated mainly by mitochondria. Knowing the neuroprotective effect of catechins, we investigated the effect of EGCG in vitro and in vivo. In isolated mitochondria from rat brain, EGCG 10, 50 and 100 μM was tested along 2 h in the presence or not of cadmium 200 μM – a high neurotoxic metal – and we concluded that EGCG presents not only an important antioxidant effect, as seen through the prevention of lipid peroxidation and total loss of mitochondrial activity induced by Cd²⁺, but presented equimolar chelation effect on this metal. However, EGCG failed to prevent the oxidation of glutathione - an important antioxidant defense - induced by Cd²⁺, suggesting that EGCG acting through the removal of reactive species generated by cadmium and by metal complexation, and these effects are not derived from an increasing glutathione levels. In an animal model of Parkinson's induced by 6- OHDA, EGCG had a beneficial effect on dopaminergic neurons death in substantia nigra, but not on motor behavior. These findings suggest that the catechins in low concentrations - such as those found physiologically (up to 2 μM) - and in relatively short period - like which remain in the body (up to 8 h) after tea consumption, are beneficial in long-term use.
2011-01-01T00:00:00ZInvestigação dos biomarcadores de inflamação e estresse oxidativo em pacientes portadores de mucopolissacaridoses tipo II e IVA e em modelo celular de mucopolissacaridose tipo II por edição gênica
http://hdl.handle.net/10183/273238
Investigação dos biomarcadores de inflamação e estresse oxidativo em pacientes portadores de mucopolissacaridoses tipo II e IVA e em modelo celular de mucopolissacaridose tipo II por edição gênica
Delgado, Camila Aguilar
As mucopolissacaridoses são doenças lisossômicas de depósito, na qual os glicosaminoglicanos, ao invés de serem clivados dentro do lisossomo, são acumulados dentro dessa organela celular, devido a uma falha nessa rota enzimática. A Mucopolissacaridose IV é caracterizada pela deficiência da enzima N-acetilgalactosamina-6-sulfatase, acumulando queratan sulfato. Já a Mucopolissacaridose tipo II é caracterizada pela deficiência da enzima iduronato-2-sulfatase e acúmulo de heparan sulfato e dermatan sulfato. Esse acúmulo de glicosaminoglicanos leva a problemas secundários, como a ativação da cascata inflamatória, a produção de espécies reativas e disfunção mitocondrial. O objetivo geral deste projeto de pesquisa foi investigar os mecanismos de estresse oxidativo e inflamação em pacientes portadores de Mucopolissacaridose tipo II no momento do diagnóstico e após o transplante de células-tronco hematopoiéticas, em pacientes portadores de Mucopolissacaridose tipo IVA durante tratamento com terapia de reposição enzimática, bem como avaliar o efeito in vitro de antioxidantes (genisteína e coenzima Q 10) sobre parâmetros de estresse oxidativo e disfunção mitocondrial em modelo celular para Mucopolissacaridose tipo II. Os dados apresentados sobre pacientes com Mucopolissacaridose tipo II sugerem que os mesmos se encontram em estado de desequilíbro redox e pró-inflamatório, com aumento dos níveis de isoprostanos urinários, das interleucinas IL-1β e IL-17a e a tendência de aumento da IL-6. Além disso, os pacientes com Mucopolissacaridose tipo II pós- transplante de células-tronco hematopoiéticas demonstraram uma melhora nos parâmetros analisados, trazendo evidências de como esse tratamento pode ser benéfico para esses pacientes. Vale ressaltar que até o momento não havia sido descrito na literatura o aumento de IL-17a em pacientes com Mucopolissacaridose tipo II. Esse dado é pioneiro e extremamente relevante, visto que essa interleucina é considerada osteoclastogênica e esses pacientes apresentam deformações ósseas importantes. Relatamos pela primeira vez que não há aumento significativo da resposta inflamatória e estresse oxidativo/nitrosativo em pacientes com Mucopolissacaridose tipo IVA em tratamento prolongado com terapia de reposição enzimática. Isso demonstra um possível efeito protetor do tratamento em relação aos parâmetros estudados e a importância de iniciar o tratamento nos estágios iniciais da doença. Já em relação ao nosso estudo de modelo celular por edição gênica, foi demonstrado que o modelo celular heterozigoto composto nocaute para Mucopolissacaridose tipo II apresenta menos alterações nos parâmetros estudados, em comparação com o modelo celular homozigoto nocaute para Mucopolissacaridose tipo II. Isso evidencia que os modelos celulares podem caracterizar diferentes fenótipos, e que a genisteína demonstrou efeito protetor contra o aumento de espécies reativas de oxigênio. Este modelo celular pode ajudar a elucidar a fisiopatologia da Mucopolissacaridose tipo II, bem como demonstrar os benefícios da genisteína nesta doença.; Mucopolysaccharidoses are lysosomal storage diseases, as glycosaminoglycans, instead of being cleaved inside the lysosome, are accumulated within this cellular organelle, due to a failure in this enzymatic route. Mucopolysaccharidoses type IV is characterized by the deficiency of the enzyme N-acetylgalactosamine 6-sulfatase, accumulating keratan sulfate. Mucopolysaccharidoses type II is described by the deficiency of the enzyme iduronate-2-sulfatase and accumulation of heparan sulfate and dermatan sulfate. This accumulation of GAG leads to secondary problems, such as the activation of the inflammatory cascade, the production of reactive species and mitochondrial dysfunction. The aim of this research project was to investigate the mechanisms of oxidative stress and inflammation in patients with Mucopolysaccharidoses type II at the time of diagnosis and post-hematopoietic stem cell transplantation, in patients with Mucopolysaccharidoses type IVA during treatment with enzyme replacement therapy, as well as to evaluate the in vitro effect of different antioxidants (genistein, coenzyme q10) on parameters of oxidative stress and mitochondrial dysfunction in cellular models for Mucopolysaccharidoses type II. The data presented about Mucopolysaccharidoses type II patients showed that they are in redox imbalance and pro-inflammatory state, with an increase in the urinary isoprostane levels, increase interleukins IL-1β and IL-17a and a tendency towards an increase in IL-6. The Mucopolysaccharidoses type II patients post- hematopoietic stem cell transplantation showed an improvement in the analyzed parameters, bringing evidences on how this treatment can be beneficial to these patients. It is worth noting that until now, an increase in IL-17a in Mucopolysaccharidoses type II patients has not been described in the literature. This data is pioneering and extremely relevant, since this interleukin is considered osteoclastogenic and these patients present significant bone deformations. We reported for the first time that there is no significant increase in the inflammatory response and oxidative/nitrosative stress in patients with Mucopolysaccharidoses type IVA on prolonged treatment with enzyme replacement therapy. This shows the protective effect of treatment in relation to the parameters studied and the importance of initiating treatment in the early stages of the disease. In relation to our study of the cellular model by gene editing, it was demonstrated that the heterozygous Mucopolysaccharidoses type II knockout cellular model presents less alterations in the parameters studied, in comparison with the homozygous Mucopolysaccharidoses type II knockout cellular model. This indicate that the cellular models can characterize different phenotypes and that genistein showed a protective effect against increased reactive oxygen species. This cellular model may help to elucidate the pathophysiology of Mucopolysaccharidoses type II, as well as demonstrate the benefits of genistein in this disease.
2023-01-01T00:00:00ZAnálise da infecção in vitro e in vivo pelo Zika vírus no desenvolvimento de doenças cardiovasculares
http://hdl.handle.net/10183/273189
Análise da infecção in vitro e in vivo pelo Zika vírus no desenvolvimento de doenças cardiovasculares
Silva, Fernanda Marques da
O Zika vírus (ZIKV) é conhecido por sua relação com complicações neurológicas, entretanto, estudos recentes também indicam que o ZIKV pode estar relacionado com o desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Diante do aumento do número de relatos de casos de pacientes com complicações cardíacas após a infecção por ZIKV, se faz necessário estudos experimentais que busquem investigar esta associação. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da infecção pelo ZIKV, in vitro, in vivo e in silico no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. No estudo in vitro células H9c2 e A7r5 foram infectadas com o ZIKV de origem brasileira, utilizando multiplicidade de infecção (MOI) de 1; 0,1 e 0,01. As células infectadas foram observadas diariamente em microscópio óptico para verificação de efeito citopático (ECP). A cada 24h pós-infecção, durante um período de 4 dias, os cultivos infectados foram congelados, descongelados e aliquotados para posterior análise de genoma viral por qPCR e titulação viral. Para análise da viabilidade celular foi realizado o teste de atividade da lactato desidrogenase (LDH) e para estresse oxidativo foi analisada a proteína carbonil e redução de NBT. No experimento in vivo, camundongos fêmeas FVB/N (n=8), com idade de 60 dias, foram inoculados com 1x10⁵ UFP de ZIKV via intravenosa. Após 4 dias de infecção, foi realizada coleta de sangue e tecido cardíaco para análise de troponina T, atividade enzimática de fatores de coagulação, aminopeptidases e análise de estresse oxidativo. Foi realizada análise estatística univariada através do teste t e ANOVA. Ainda, correlacionamos genes listados na Zika Virus Infection Database (ZIKAVID) aos genes ligados ao estresse oxidativo da Mouse Genome Database (MGD) a fim de verificar associação entre doenças cardíacas, estresse oxidativo e o ZIKV. As linhagens celulares apresentaram ECP característico de infecção viral e o RNA genômico foi detectado em todos os períodos analisados. A linhagem H9c2 produziu uma quantidade de vírus significativamente superior à A7r5 e analisando o estresse oxidativo após infecção, verifica-se que os níveis médios de conteúdo carbonil foram significativamente maiores nas linhagens celulares infectadas. Já in vivo, nas fêmeas infectadas houve um aumento significativo de troponina T quando comparado ao grupo controle. Ainda, observou-se um aumento significativo da atividade de enzimas fibrinolíticas e níveis elevados das aminopeptidases. Também, os resultados demonstraram alto índice de estresse oxidativo no tecido cardíaco de camundongos infectados. Conclui-se que além da suscetibilidade celular ao ZIKV, animais imunocompetentes infectados apresentam marcador de injúria celular elevado com ativação de enzimas pró-coagulantes e uma regulação negativa da fibrinólise, o que provavelmente indica um estado pró- trombótico nesses animais, evidenciando uma associação entre o vírus e complicações cardíacas.; The Zika virus (ZIKV) is known for its relationship with neurological complications, however, recent studies also indicate that ZIKV may be related to the development of cardiovascular diseases. In view of the increasing number of case reports of patients with cardiac complications after ZIKV infection, experimental studies are needed to investigate this association. The aim of this study was to evaluate the effects of ZIKV infection, in vitro, in vivo and in silico on the development of cardiovascular diseases. In the in vitro study, H9c2 and A7r5 cells were infected with ZIKV of brazilian origin, using a multiplicity of infection (MOI) of 1; 0.1 and 0.01. Infected cells were observed daily under an optical microscope to verify the cytopathic effect (CPE). Every 24h post-infection, during a period of 4 days, the infected cultures were frozen, thawed and aliquoted for subsequent analysis of the viral genome by qPCR and viral titration. For cell viability analysis, the lactate dehydrogenase (LDH) activity test was performed and for oxidative stress, carbonyl protein and NBT reduction were analyzed. In the in vivo experiment, female FVB/N mice (n=8), aged 60 days, were inoculated with 1x10⁵ PFU of ZIKV intravenously. After 4 days of infection, blood and cardiac tissue were collected for analysis of troponin T, enzymatic activity of clotting factors, aminopeptidases, analysis of oxidative stress. Univariate statistical analysis was performed using the t test and ANOVA. Furthermore, we correlated genes listed in the Zika Virus Infection Database (ZIKAVID) with genes linked to oxidative stress from the Mouse Genome Database (MGD) in order to verify an association between heart disease, oxidative stress and ZIKV. The cell lines showed CPE characteristic of viral infection and genomic RNA was detected in all analyzes periods. The H9c2 cells produced a significantly higher amount of virus than A7r5 and analyzing the oxidative stress after infection, it appears that the average levels of carbonyl content were significantly higher in the infected cell lines. In vivo, in infected females, there was a significant increase in troponin T when compared to the control group. Furthermore, there was a significant increase in the activity of fibrinolytic enzymes and high levels of aminopeptidases. Also, the results showed a high rate of oxidative stress in the heart tissue of infected mice. It is concluded that in addition to cellular susceptibility to ZIKV, infected immunocompetent animals have a high marker of cell injury with activation of procoagulant enzymes and a negative regulation of fibrinolysis, which probably indicates a prothrombotic state in these animals, evidencing an association between the virus and heart complications.
2022-01-01T00:00:00Z