UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CONTROLE DE QUALIDADE DO CLORIDRATO DE SIBUTRAMINA MATÉRIA-PRIMA E CÁPSULAS EM FARMÁCIAS MAGISTRAIS E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE LETÍCIA FLORES DA SILVA MARTINS PORTO ALEGRE, 2008. UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE FARMÁCIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CONTROLE DE QUALIDADE DO CLORIDRATO DE SIBUTRAMINA MATÉRIA-PRIMA E CÁPSULAS EM FARMÁCIAS MAGISTRAIS E AVALIAÇÃO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE Dissertação apresentada por Letícia Flores da Silva Martins para obtenção do GRAU DE MESTRE em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dr. Ana Maria Bergold PORTO ALEGRE, 2008. Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e aprovada em 28.03.2008, pela Comissão Examinadora constituída por: Profa. Dr. Célia Machado Gervásio Chaves Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS Prof. Dr. Jarbas Alves Montanha Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS Profa. Dr. Marlise Araújo dos Santos Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul – PUCRS M386c Martins, Letícia Flores da Silva Controle de qualidade do cloridrato de sibutramina matéria-prima e cápsulas em farmácias magistrais e avaliação preliminar da estabilidade / Letícia Flores da Silva Martins – Porto Alegre : UFRGS, 2008. – xxv p., 129 p. : il., tab., gráf. Dissertação (mestrado). UFRGS. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas. 1. Sibutramina. 2. Controle de qualidade de medicamentos. 3. Estabilidade. 4. Cromatografia líquida de alta eficiência. 5. Volumetria. 6. Farmácia magistral. I. Bergold, Ana Maria. II. Título. CDU: 615.2.07 Bibliotecária responsável: Margarida Maria Cordeiro Fonseca Ferreira – CRB10/480 "Leva tempo para alguém ser bem sucedido porque o êxito não é mais do que a recompensa natural pelo tempo gasto em fazer algo direito." (Joseph Ross) AGRADECIMENTOS À Profa. Dr. Ana Maria Bergold, pela orientação desde o período de graduação até o momento, amizade e exemplo de profissionalismo. Ao Laboratório de Química Farmacêutica, onde foi realizada a maior parte deste trabalho, pela disponibilidade de materiais e equipamentos. Ao Prof. Dr. Pedro Fröehlich e Prof. Dr. Jarbas Montanha, pelos esclarecimentos prestados. Ao Prof. Dr. César Petzold, do Instituto de Química da UFRGS, pelo auxílio na interpretação das análises térmicas. Aos professores do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas (PPGCF), pelo ensino de qualidade. À UFRGS e à Faculdade de Farmácia, por contribuírem para a minha formação acadêmica. À Lúcia, bolsista de iniciação científica, pelo auxílio na realização de algumas técnicas deste trabalho. À Miriam, da Farmácia Rosa Moschetta, pelo apoio profissional e auxílio na aquisição das matérias-primas utilizadas neste trabalho. A todos os colegas do Laboratório de Química Farmacêutica, pela amizade e troca de conhecimentos: Sirlei, Carolina, Lisiane, Eliane, Rochele, Maria Cristina, Daniele, Laura, Samuel, Andréa Adams, Marquinho, Luís, Tiago, Jéferson, Leonardo, Dênis, Andréia Pereira, Graziela, Marcela e Natália. À Profa. Dr. Naira Balzaretti, do Laboratório de Altas Pressões e Materiais Avançados da UFRGS, pela realização dos espectros de infravermelho. À Profa. Dr. Izabel Riegel, do Instituto de Ciências Exatas e Tecnológicas do Centro Universitário Feevale, pela realização das análises termogravimétricas. À Simone, do Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTF), pela realização das análises de DSC. Ao Alex, meu esposo, pelo carinho, companheirismo e incentivo. Aos meus pais (Celso e Luiza), meus irmãos (Vinícius e Jaqueline), minha família e amigos pelo carinho e constante apoio. Ao CNPq, pelo financiamento da bolsa de estudos. VI SUMÁRIO Lista de Figuras ........................................................................................................ Lista de Tabelas ....................................................................................................... Lista de Quadros ...................................................................................................... Lista de Abreviaturas ................................................................................................ Resumo .................................................................................................................... Abstract .................................................................................................................... XIII XVII XIX XXI XXIII XXV 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 1 2 OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................... 7 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................. 3.1 OBESIDADE ...................................................................................................... 3.2 TERAPÊUTICA PARA A OBESIDADE ............................................................. 3.3 CLORIDRATO DE SIBUTRAMINA .................................................................... 3.3.1 Aspectos gerais ............................................................................................... 3.3.2 Aspectos físico-químicos ................................................................................. 3.3.3 Aspectos terapêuticos ..................................................................................... 3.3.3.1 Formulações farmacêuticas .......................................................................... 3.3.3.2 Indicações e efeitos ...................................................................................... 3.3.3.3 Posologia ...................................................................................................... 3.3.3.4 Toxicologia e abuso ...................................................................................... 3.3.3.5 Mecanismo de ação ...................................................................................... 3.3.3.6 Farmacocinética ........................................................................................... 11 13 15 18 18 18 20 20 20 21 22 22 23 3.3.3.7 Precauções e contra-Indicações .................................................................. 3.3.3.8 Interações medicamentosas ......................................................................... 3.3.3.9 Reações adversas ........................................................................................ 3.3.4 Determinação em fluidos biológicos ................................................................ 3.3.5 Controle de qualidade ...................................................................................... 3.3.6 Estabilidade ..................................................................................................... 24 25 26 27 28 30 4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 4.1 SUBSTÂNCIA QUÍMICA DE REFERÊNCIA E AMOSTRAS ............................ 4.2 ANÁLISE QUALITATIVA ...................................................................... 4.2.1 Descrição ......................................................................................................... 4.2.2 Solubilidade ..................................................................................................... 4.2.3 Determinação do pH em solução .................................................................... 4.2.4 Determinação da faixa de fusão ...................................................................... 4.2.4.1 Equipamento Mettler Toledo, modelo FP90 ................................................. 4.2.4.2 Equipamento de bloco metálico aquecido, segundo Koffler ......................... 4.2.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ..................................................... 4.2.6 Termogravimetria (TGA) .................................................................................. 4.2.7 Reação para cloretos ...................................................................................... 4.2.8 Reação para aminas terciárias ........................................................................ 4.2.9 Rotação óptica específica ................................................................................ 4.2.10 Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................................... 4.2.11 Espectroscopia na região do infravermelho (IV) ............................................ 4.2.12 Espectroscopia na região do ultravioleta (UV) .............................................. 4.2.13 Aquametria .................................................................................................... 4.2.13.1 Método volumétrico por Karl-Fischer .......................................................... 4.2.13.2 Método gravimétrico ................................................................................... 33 35 36 36 36 36 37 37 37 38 39 39 40 40 41 42 43 43 43 44 4.3 ANÁLISE QUANTITATIVA ................................................................................ 4.3.1 Volumetria em meio não-aquoso (VMNA) ....................................................... 4.3.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .............................................. 4.3.2.1 Especificidade ............................................................................................... 4.3.2.1.1 4.3.2.1.2 4.3.2.1.3 4.3.2.1.4 4.3.2.1.5 4.3.2.1.6 Temperatura ............................................................................................ Luz ultravioleta......................................................................................... Hidrólise ácida.......................................................................................... Hidrólise alcalina...................................................................................... Oxidação.................................................................................................. Solução simulada de excipientes............................................................. 44 44 46 47 47 48 48 48 49 49 49 50 51 52 54 55 55 55 55 4.3.2.2 Linearidade ................................................................................................... 4.3.2.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) ....................................... 4.3.2.4 Precisão ........................................................................................................ 4.3.2.5 Exatidão ........................................................................................................ 4.3.2.2 Robustez ....................................................................................................... 4.3.3. Comparação estatística entre os métodos de doseamento ........................... 4.4 ESTUDO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE .................................................... 4.4.1 Exposição à temperatura elevada ................................................................... 4.4.2 Exposição à radiação ultravioleta .................................................................... 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 5.1 SUBSTÂNCIA QUÍMICA DE REFERÊNCIA E AMOSTRAS............................. 5.2 ANÁLISE QUALITATIVA ...................................................................... 5.2.1 Descrição ......................................................................................................... 5.2.2 Solubilidade ..................................................................................................... 5.2.3 Determinação do pH em solução .................................................................... 5.2.4 Determinação da faixa de fusão ...................................................................... 57 59 60 60 61 63 64 5.2.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) ..................................................... 5.2.6 Termogravimetria (TGA) .................................................................................. 5.2.7 Reação para cloretos ....................................................................................... 5.2.8 Reação para aminas terciárias ........................................................................ 5.2.9 Rotação óptica específica ................................................................................ 5.2.10 Cromatografia em camada delgada (CCD) ................................................... 5.2.11 Espectroscopia na região do infravermelho (IV) ............................................ 5.2.12 Espectroscopia na região do ultravioleta (UV) .............................................. 5.2.13 Aquametria .................................................................................................... 5.2.13.1 Método volumétrico por Karl-Fischer .......................................................... 5.2.13.2 Método gravimétrico ................................................................................... 5.3 ANÁLISE QUANTITATIVA ................................................................................ 5.3.1 Volumetria em meio não-aquoso (VMNA) ....................................................... 5.3.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) .............................................. 5.3.2.1 Especificidade ............................................................................................... 5.3.2.1.1 Temperatura .............................................................................................. 5.3.2.1.2 Luz ultravioleta ........................................................................................... 5.3.2.1.4 Hidrólise ácida ........................................................................................... 5.3.2.1.5 Hidrólise alcalina ....................................................................................... 5.3.2.1.6 Oxidação ................................................................................................... 5.3.2.1.7 Solução simulada de excipientes .............................................................. 5.3.2.2 Linearidade ................................................................................................... 5.3.2.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) ....................................... 5.3.2.4 Precisão ........................................................................................................ 5.3.2.5 Exatidão ........................................................................................................ 5.3.2.2 Robustez ....................................................................................................... 5.3.3. Comparação estatística entre os métodos de doseamento ........................... 66 70 73 74 75 75 78 79 81 81 83 85 85 88 91 91 92 93 94 95 96 97 98 98 99 100 101 5.4 ESTUDO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE .................................................... 5.4.1 Exposição à temperatura elevada ................................................................... 5.4.2 Exposição à radiação ultravioleta .................................................................... 102 103 105 6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 107 7. REFERÊNCIAS .................................................................................................... 111 ANEXO ..................................................................................................................... 125 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química do cloridrato de sibutramina monoidratado .................... Figura 2. Estruturas químicas de: metabólito 1 (I) e metabólito 2 (II) ......................... Figura 3. Termogramas obtidos para: SQR (preto) e SIB1 (vermelho), de acordo com as condições analíticas descritas para a técnica de DSC no Quadro 7 (p. 38); SIB1 (azul) com velocidade de aquecimento 40 ºC/min e demais condições mantidas ...................................................................................................................... Figura 4. Termogramas obtidos para: SIB2 (preto) e SIB3 (vermelho), de acordo com as condições analíticas descritas para a técnica de DSC no Quadro 7 (p. 38) ... Figura 5. Curva termogravimétrica da SQR obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39) TGA (preto) e DTG (vermelho) ................................................................ Figura 6. Curva termogravimétrica da SIB1 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39) TGA (preto) e DTG (vermelho) ................................................................ Figura 7. Curva termogravimétrica da SIB2 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39) TGA (preto) e DTG (vermelho) ................................................................ Figura 8. Curva termogravimétrica da SIB3 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39) TGA (preto) e DTG (vermelho) ................................................................ Figura 9. Estruturas químicas correspondentes a: etilamina (A), cloridrato de fluoxetina (B) e trietilamina (C) .................................................................................... Figura 10. Estrutura química do cloridrato de diltiazem .............................................. Figura 11. Placa cromatográfica obtida por CCD para a substância de referência cloridrato de diltiazem (DIL), SQR, amostra SIB1 e amostra SIB1 submetida à 105 ºC por 5 horas. Fase estacionária: cromatoplacas de gel de sílica GF 254 Merck. Fase móvel: etanol P.A. Revelação: lâmpada UV 254 nm (A) e vapores de iodo (B).. Figura 12. Espectros de infravermelho obtidos para SQR (preto), SIB1 (vermelho) .. Figura 13. Espectros obtidos na região do ultravioleta para a SQR do cloridrato de sibutramina em solução, diluído nos solventes: ácido clorídrico 0,1 M (preto), metanol (azul) e etanol (vermelho) .............................................................................. 19 24 67 68 70 71 71 72 74 76 77 78 80 Figura 14. Espectros obtidos na região do ultravioleta para SQR e SIB1, em solução etanólica ......................................................................................................... Figura 15. Cromatogramas obtidos para SQR (preto), SIB1 (vermelho), CAP (azul) 60 µg/mL e excipientes de CAP, diluídos na fase móvel, de acordo com o método desenvolvido por CLAE. Condições de análise: coluna Macherey-Nagel Nucleosil ® C8 ec, 150 x 4,0 mm, partículas 5 µm, poros 100 ?; fase móvel: ACN e água (75:25 V/V), 0,3% trietilamina, pH 7,0 (H3PO4); λ = 225 nm; fluxo 1,2 mL/min ...................... Figura 16. Cromatograma da solução de SQR (preto) e CAP (vermelho) 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, após serem submetidas à temperatura de 80 ºC, durante 24 horas, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 (p. 47) ............................................................................................................................... Figura 17. Cromatograma da SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel, sem incidência de radiação (preto) e após ser submetido à luz ultravioleta 254 nm durante 24 horas (vermelho), conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 (p. 47) ........................................................................................................ Figura 18. Cromatogramas obtidos após hidrólise ácida durante duas horas para: cloridrato de sibutramina em soluções 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, de SQR (preto) e de CAP (vermelho); branco (azul). Análise conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 ..................................................................... Figura 19. Cromatogramas obtidos após hidrólise alcalina durante duas horas para: cloridrato de sibutramina em soluções 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, de SQR (A) e de CAP (B); branco (C). Análise conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 ............................................................................................... Figura 20. Cromatograma da solução de cloridrato de sibutramina monoidratado 60 µg/mL, diluída em fase móvel, após oxidação com peróxido de hidrogênio 10% durante duas horas. Análise de SQR (preto), CAP (vermelho) e branco (azul), conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 .................................... Figura 21. Representação gráfica da curva padrão obtida para o cloridrato de sibutramina monoidratado por CLAE, conforme método descrito no Quadro 10 (p. 47) ................................................................................................................................ Figura 22. Cromatogramas da solução de cloridrato de sibutramina monoidratado (SQR) 60 µg/mL, diluída em fase móvel, antes (preto) e após ser submetida à temperatura de 60 ºC, durante um (vermelho), dois (azul), quatro (verde) e dez (violeta) dias, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 ............. Figura 23. Espectro de UV do pico com tR de três minutos, obtido após exposição da solução de SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel à radiação UV 254 nm por dez dias .............................................................................................................................. 81 90 92 93 94 95 96 97 104 105 Figura 24. Cromatogramas da solução de cloridrato de sibutramina monoidratado (SQR) 60 µg/mL, diluída em fase móvel após ser submetida à radiação UV 254 nm, durante um (A), dois (B), três (C) e quatro (D) dias, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 ..................................................................... 106 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Esquema de diluições utilizado nas curvas padrão, a partir de uma solução estoque contendo 250 µg/mL da SQR ........................................................................... Tabela 2. Esquema para o preparo das soluções para avaliação da recuperação do cloridrato de sibutramina na sua determinação em cápsulas ......................................... Tabela 3. Média da determinação do pH de soluções aquosas a 2% da SQR e amostra SIB1 .................................................................................................................. Tabela 4. Comparação dos valores das faixas de fusão obtidas para SQR e SIB1, pelo fornecedor e pelos equipamentos segundo Koffler, Mettler Toledo e DSC ............ Tabela 5. Dados obtidos pela técnica de DSC para SQR e amostras SIB1, SIB2 e SIB3................................................................................................................................. Tabela 6. Dados obtidos pela técnica de TGA para SQR e amostras SIB1, SIB2 e SIB3 .............................................................................................................................................. Tabela 7. Média de três determinações do poder rotatório específico para soluções etanólicas a 1% de SQR e amostra SIB1 ....................................................................... Tabela 8. Resultados obtidos para a determinação da aquametria pelo método de Karl-Fischer, para SQR e SIB1, em três dias diferentes ................................................ Tabela 9. Resultados obtidos para a determinação da aquametria pelo método gravimétrico, para SQR e SIB1, sob diferentes condições .................... Tabela 10. Comparação dos teores de SIB1 obtidos através de diferentes métodos de VMNA, calculados em relação à substância seca .......................... Tabela 11. Avaliação dos parâmetros cromatográficos, para o método desenvolvido por CLAE, para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado ..................... Tabela 12. Resultados obtidos para a repetibilidade e precisão intermediária, referentes ao método desenvolvido por CLAE para o doseamento do cloridrato de sibutramina na forma de matéria-prima (amostra SIB1) ................................................. Tabela 13. Resultados obtidos para a repetibilidade e precisão intermediária, referentes ao método desenvolvido por CLAE para o doseamento do cloridrato de sibutramina na forma de produto acabado (amostra CAP) ............................................ 50 53 63 64 69 72 75 82 83 88 91 99 99 Tabela 14. Resultados da recuperação do cloridrato de sibutramina em cápsulas ....... Tabela 15. Parâmetros cromatográficos e teor da amostra SIB1 para variações do método desenvolvido por CLAE para o cloridrato de sibutramina .................................. Tabela 16. Comparação dos resultados dos teores obtidos por CLAE e pelos métodos 4 e 5 por VMNA ............................................................................................... Tabela 17. Teores de SQR após ser submetida à temperatura de 60 °C, em diferentes tempos ........................................................................................................... Tabela 18. Teores de SQR 60 µg/mL, diluída na fase móvel, após ser submetida à radiação UV 254 nm, em diferentes tempos .................................................................. Tabela 19. Análise de variância (ANOVA) comparando os resultados obtidos pelos seis métodos por VMNA ................................................................................................. Tabela 20. Áreas absolutas dos picos cromatográficos obtidos para cada concentração das três curvas padrão obtidas por CLAE ............................................... Tabela 21. Análise de variância (ANOVA) para três curvas padrão realizadas para o método por CLAE ........................................................................................................... Tabela 22. Análise de variância (ANOVA) comparando os resultados obtidos por CLAE e pelos métodos 4 e 5 por VMNA ........................................................................ 100 101 102 103 106 ANEXO ANEXO ANEXO ANEXO LISTA DE QUADROS Quadro 1. Classificação da obesidade descrita pela WHO (2006 b), relacionando o valor do IMC em adultos de ambos os sexos com o risco de co-morbidade ................. Quadro 2. Classificação dos principais fármacos para perda de peso, de acordo com o respectivo mecanismo de ação (FUCHS et al, 2004) .................................................. Quadro 3. Dados referentes ao registro e molécula das formas de apresentação da sibutramina ..................................................................................................................... Quadro 4. Comparação das condições gerais empregadas para determinação de sibutramina e seus metabólitos em plasma humano, por CLAE .................................... Quadro 5. Comparação das condições gerais empregadas para determinação de sibutramina e seus enantiômeros em matéria-prima, através de CLAE ........................ Quadro 6. Características das amostras de matérias-primas de cloridrato de sibutramina monoidratado utilizadas no presente trabalho ............................................ Quadro 7. Especificações dos parâmetros experimentais utilizados na calorimetria exploratória diferencial às quais as amostras e SQR foram submetidas ......................................................................................................................................... Quadro 8. Condições cromatográficas empregadas para análise por CCD de SQR, SIB1 e CAP ..................................................................................................................... Quadro 9. Descrição quali e quantitativa das soluções e reagentes empregados em cada método testado por VMNA para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado .................................................................................................................. Quadro 10. Condições cromatográficas utilizadas para a validação do método por CLAE para a análise do cloridrato de sibutramina monoidratado .................................. Quadro 11. Modificações das condições cromatográficas para a avaliação da robustez do método por CLAE ....................................................................................... Quadro 12. Avaliação da solubilidade para SQR e SIB1, conforme a classificação descrita na F. Bras. IV (1988) ......................................................................................... Quadro 13. Atribuições às principais bandas do espectro de infravermelho para o cloridrato de sibutramina monoidratado ......................................................................... 14 16 19 28 30 35 38 41 45 47 54 62 79 Quadro 14. Recomendação da quantidade de amostra a ser utilizada para análise no equipamento para determinação de água (método de Karl-Fischer), de acordo com a especificação de umidade descrita no manual do equipamento DL 37 Mettler Toledo. ANEXO LISTA DE ABREVIATURAS ACN: acetonitrila CAP: cápsulas CAS: Chemical Abstracts Service DAD: detector de arranjo de fotodiodos CID: código internacional de doenças DSC: calorimetria exploratória diferencial ESI: ionização por eletrospray IMC: índice de massa corporal IV: infravermelho P.A.: reagente grau analítico Rf: fator de retenção Rx: Rf amostra/Rf referência SIB: cloridrato de sibutramina monoidratado SQR: substância química de referência TEA: trietilamina TR: tempo de retenção TGA: termogravimetria UV: ultravioleta VMNA: volumetria em meio não-aquoso RESUMO Controle de qualidade do cloridrato de sibutramina matéria-prima e cápsulas em farmácias magistrais e avaliação preliminar da estabilidade O cloridrato de sibutramina monoidratado está entre os anorexígenos mais prescritos e adquiridos em farmácias magistrais. No entanto, esse fármaco não possui metodologia oficial para o seu controle de qualidade, nem estudos de estabilidade. Considerando tais aspectos, o presente trabalho objetiva o desenvolvimento e a validação de métodos para o controle de qualidade do cloridrato de sibutramina em farmácias magistrais, na forma de matéria-prima e cápsulas, comparando-os com técnicas instrumentais, bem como realizar o estudo preliminar de sua estabilidade. As amostras de cloridrato de sibutramina foram caracterizadas e identificadas pelos métodos qualitativos: características organolépticas, solubilidade, pH, faixa de fusão, calorimetria exploratória diferencial, termogravimetria, reações de identificação, rotação óptica específica, cromatografia em camada delgada, espectrofotometria na região do infravermelho, espectrofotometria na região do ultravioleta e aquametria. Desenvolveram-se dois métodos para a quantificação do cloridrato de sibutramina: volumetria em meio não-aquoso e cromatografia líquida de alta eficiência. Testaram-se seis métodos por volumetria em meio não-aquoso para matéria-prima, sendo três deles com utilização de uma mistura de ácido acético glacial e acetato mercúrico e os demais com uma mistura de ácido acético glacial e anidrido acético. Os resultados obtidos pelos seis métodos de volumetria em meio nãoaquoso foram comparados estatisticamente através da análise de variância e não demonstraram diferença significativa. Sugeriram-se dois métodos de volumetria em meio não-aquoso com uso da mistura de ácido acético glacial e anidrido acético, mais seguros que com ácido acético glacial e acetato mercúrico, para serem utilizados em farmácias magistrais. Não houve diferença significativa entre os resultados obtidos por esses dois métodos quando comparados com o método por cromatografia líquida de alta eficiência previamente validado. O último método também foi validado para a determinação de cloridrato de sibutramina em cápsulas. O estudo preliminar de estabilidade, avaliado por cromatografia líquida de alta eficiência, apresentou sinais de formação de produtos de degradação quando o cloridrato de sibutramina foi exposto a condições de estresse à temperatura de 60 ºC e radiação UV 254 nm, durante 10 dias. Palavras-chave: controle de qualidade; farmácia magistral; sibutramina; v olumetria em meio nãoaquoso; cromatografia líquida de alta eficiência; estabilidade. ABSTRACT Quality control of sibutramine hydrochloride bulk and capsules in compounding pharmacies and preliminary stability evaluation Sibutramine hydrochloride (SIB) is one of the anorexigens with more prescriptions, mainly acquired in compounding pharmacies. However, this drug do not have an official methodology to quality control, neither stability studies. Then, the purpose of this work are the development and the v alidation of methods to sibutramine hydrochloride quality control in compounding pharmacies, in bulk and in capsules, by comparison with instrumental techniques. Addicionally, the preliminary stability study was performed. The sibutramine hydrochloride samples were characterized and identified by qualitative methods: organoleptic characters, solubility, pH, melting range, differential scanning calorimetry, termogravimetry, identification reactions, specific rotation, thin layer chromatography, infrared spectrofotometry, ultraviolet spectrofotometry and water determination. Two methods were developed to sibutramine hydrochloride quantification: non-aqueous titrimetry and high-pressure liquid chromatography. Six methods were tried by non-aqueous titrimetry for bulk assay determination, three of them with the use of a glacial acetic acid and mercuric acetate mixture and the others with a glacial acetic acid and acetic anhydrid mixture. The obteined results by the six non-aqueous titrimetry methods were statistically compared by analisys of variance and did not show significative difference. Two methods were suggested with the glacial acetic acid and acetic anhydrid mixture, which is safer than glacial acetic acid and mercuric acetate mixture, to be used in compounding pharmacies. There was no significative difference beetwen the obtained results when non-aqueous titrimetry methods were compared with the previously validated HPLC method. HPLC was also validated for sibutramine hydrochloride assay in capsules. The preliminary stability study, evaluated by HPLC, showed degradation products signs when the drug was exposed to the stress conditions: 60 ºC temperature and UVB radiation, for 10 days. Key-words: quality control; compounding pharmacy; sibutramine; non-aqueous titrimetry; highpressure liquid chromatography; stability. 1. INTRODUÇÃO ___________________________________________________________________ __ 1. Introdução O estilo contemporâneo de vida, associado ao sedentarismo e consumo de alimentos calóricos, tem contribuído para o elevado índice mundial de obesidade e sobrepeso. Dados obtidos em 2005 mostraram que a obesidade atinge cerca de 400 milhões de adultos no mundo e 1,6 bilhões apresentam sobrepeso (RANG et al, 2007; WHO, 2006 a). Nos Estados Unidos, uma pesquisa concluiu que cerca de 33% da população adulta é obesa. Em muitos países da Europa, esse índice corresponde de 15 a 25% dos adultos (IOTF, 2008). De acordo com dados obtidos em 2002 e 2003, extrapolou-se que a obesidade ocorre em 8,9% dos homens e 13,1% das mulheres no Brasil (IBGE, 2003). Muitos tratamentos farmacológicos são recomendados para a redução de peso. Os principais são os anorexígenos, também conhecidos como supressores do apetite. Essa classe de medicamentos apresenta efeitos colaterais importantes sob o ponto de vista cardiovascular e em nível de sistema nervoso central (SNC) (KOROLKOVAS et al, 2007; USP DI, 2005). Assim, sua prescrição deve ser criteriosa, evitando o uso indevido e indiscriminado. Contudo, no Brasil há um consumo exagerado de anorexígenos em relação aos demais países. De acordo com o relatório anual da International Narcotics Control Board, a população brasileira é a maior consumidora mundial per capita dos anorexígenos anfetamínicos com a finalidade de emagrecimento, ou seja, 9,1 doses diárias para cada 1.000 habitantes (INCB, 2007). Além disso, são comuns as prescrições com doses maiores que as usuais, em associações perigosas e para pacientes portadores de patologias que não justificam o uso desses medicamentos. Preocupada com tal problema de saúde pública em nosso país, a ANVISA instituiu uma regulamentação mais restritiva para os anorexígenos. Essa inclui novas regras que devem ser observadas por profissionais prescritores, farmacêuticos e farmácias (BRASIL, 2007 a). Presume-se que a maior parte dos anorexígenos consumidos no Brasil, como anfepramona, femproporex e mazindol, sejam provenientes de farmácias magistrais 3 __ 1. Introdução (ABESO, 2006; CARNEIRO et al, 2005). Outro medicamento dessa classe, cuja aquisição é us ual em tais empresas, é a sibutramina. O último fato é justificado, principalmente, porque sua especialidade farmacêutica é onerosa. As farmácias magistrais representam um segmento bastante difundido na área da saúde. O número desses estabelecimentos cresce rapidamente no Brasil. Em 2004, foi estimado um total de 5.356 farmácias magistrais ativas no país (ANFARMAG, 2008; SOUZA, 2005), sendo 947 delas no Rio Grande do Sul1 . Entretanto, o setor magistral tem sido alvo de polêmica, principalmente após os problemas ocorridos com as substâncias de baixo índice terapêutico (CFF, 2003). A divulgação de tais fatos na mídia provocou desconfiança aos consumidores. As farmácias, responsáveis pelo acesso aos medicamentos de mais de 55 milhões de brasileiros (TOKARSKI, 2002), precisam demonstrar a sua credibilidade. Sendo o Brasil um país com várias carências na área da saúde, inúmeros tratamentos são garantidos aos pacientes pelas farmácias magistrais. Essas oferecem medicamentos personalizados em doses nem sempre disponíveis comercialmente (LEAL et al, 2007). O setor magistral, apresentando esse papel relevante na política sanitária, deve ser qualificado por educação continuada dos colaboradores, respaldo científico das formulações aviadas e aprimoramento de seus próprios laboratórios de controle de qualidade. Geraram-se, assim, muitas discussões técnicas entre as instituições do sistema de saúde brasileiro para a publicação de normas técnicas destinadas às farmácias magistrais. Dessa maneira, a ANVISA promoveu uma Consulta Pública (BRASIL, 2005) com alteração de normas legais pré-existentes (BRASIL, 2000; BRASIL, 2003 a), as quais foram revogadas e levaram ao advento da Resolução RDC nº 214 (BRASIL, 2006 b). Posteriormente, a última resolução foi substituída, com alterações, para a atual RDC nº 67 (BRASIL, 2007 b). _________________________________________________________________________________ 1. Comunicação pessoal: CRF-RS. Conselho Regional de Farmácia do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, 07 de junho de 2006. 4 __ 1. Introdução Uma das principais exigências da Resolução atual está relacionada com o controle de qualidade de fármacos, produtos intermediários e medicamentos manipulados nas farmácias magistrais (BRASIL, 2007 b). Essa área de conhecimento é de extrema importância para a garantia da qualidade dos medicamentos dispensados aos usuários. Sendo assim, tais estabelecimentos necessitam de metodologia validada e simples, para a realização de análises de rotina no seu próprio laboratório de controle de qualidade. Entretanto, as monografias de muitos fármacos utilizados em farmácias não constam em farmacopéias. O anorexígeno cloridrado de sibutramina, por exemplo, fármaco cuja patente foi recém extinta (ABBOTT, 2006 a), não possui a descrição de uma metodologia analítica com prática viável em farmácias magistrais. Sua estabilidade química também não foi determinada. Frente às situações expostas, julgaram-se necessários o desenvolvimento e a validação de metodologia para análise desse fármaco e de sua forma farmacêutica, bem como um estudo preliminar de sua estabilidade. Esses aspectos foram determinados e avaliados no presente trabalho. 5 2. OBJETIVOS ___________________________________________________________________ __ 2.1 OBJETIVOS GERAIS 2. Objetivos Desenvolver e/ou validar métodos analíticos para o cloridrato de sibutramina monoidratado matéria-prima e na forma farmacêutica cápsulas, os quais sejam adequados para a realização do controle de qualidade em farmácias magistrais e/ou por técnicas instrumentais. Adicionalmente, realizar os estudos preliminares de estabilidade. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Desenvolver análises qualitativas, bem como avaliar a SQR e as amostras de cloridrato de sibutramina monoidratado matéria-prima e cápsulas, quando cabível, por meio de: descrição; testes de solubilidade; pH de solução aquosa; faixa de fusão, por diferentes métodos; calorimetria exploratória diferencial (DSC); análise termogravimétrica (TGA); reações de identificação de grupos químicos; rotação óptica específica; cromatografia em camada delgada (CCD); espectrofotometria na região do infravermelho (IV); espectrofotometria na região do ultravioleta (UV); teor de água. b) Desenvolver e validar metodologia analítica para a quantificação do fármaco puro e em cápsulas, através de cromatografia líquida de alta eficiência; c) Desenvolver e validar metodologia analítica para quantificação do fármaco puro, por volumetria em meio não-aquoso com uso de química limpa e realizável em farmácias magistrais; 9 __ 2. Objetivos d) Proceder à comparação estatística entre os métodos de doseamento propostos para a matéria-prima; e) Realizar estudos preliminares quanto à estabilidade do cloridrato de sibutramina monoidratado. 10 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ___________________________________________________________________ ____ 3.1 OBESIDADE Nos últimos anos, a prevalência da 3. Revisão Bibliográfica obesidade tem aumentado substancialmente em todo o mundo. A doença é uma das graves conseqüências oriundas da modernização e industrialização crescentes. O problema também é estendido a crianças e adolescentes, o que representa um sério problema de saúde em nível mundial (WHO, 2006 a). Dados epidemiológicos demonstram que é crescente o número de mortes relacionadas à obesidade (WHO, 2006 a). Na obesidade pronunciada, por exemplo, em que o indivíduo apresenta um índice de massa corporal (IMC) superior a 40 kg/m2, a mortalidade é aumentada em 12 vezes, considerando um grupo de faixa etária de 25 a 35 anos (RANG et al, 2007). Justificativas para esses fatos são: o consumo predominante de alimentos processados, com elevada densidade energética, alto teor de lipídeos e carboidratos, além da reduzida quantidade de atividade física (WHO, 2006 a). Dados obtidos nos Estados Unidos demonstraram que nos últimos 100 anos o consumo de gorduras foi aumentado em 67% e o de açúcar em 64%. Enquanto o consumo de verduras e legumes reduziu 26% e o de fibras, 18% (COUTINHO, 2007). A obesidade é uma condição de acúmulo anormal ou excessivo de gordura no tecido adiposo, numa extensão em que a saúde do paciente pode ser prejudicada. Essa definição foi oficialmente adotada pela Organização Mundial de Saúde (WHO, 2006 a). Um dos principais diagnósticos para a classificação do grau da enfermidade relacionada ao aumento do peso é embasado no cálculo do IMC. Esse valor correspondente à divisão da massa corporal (em quilogramas) do indivíduo pelo quadrado de sua altura (em metros). Uma classificação da obesidade relacionando o valor do IMC ao risco de comorbidade é apresentada no Quadro 1. No entanto, a avaliação da obesidade em crianças de 5 a 14 anos não é padronizada (WHO, 2006 a). 13 ____ 3. Revisão Bibliográfica Quadro 1. Classificação da obesidade descrita pela WHO (2006 b), relacionando o valor do IMC em adultos de ambos os sexos com o risco de co-morbidade. Classificação Normal Sobrepeso Obeso Classe I Obeso Classe II Obeso Classe III IMC 18,50 - 24,99 25,00 - 29,99 30,00 - 34,99 35,00 - 39,99 ≥ 40,00 Risco de co-morbidade Normal Aumentado Moderado Grave Muito grave A obesidade é decorrente de um desequilíbrio na regulação homeostática do balanço energético, uma relação controlada pelo hipotálamo, entre o consumo de energia e ingestão de calorias. Assim, pode ter origem endógena ou exógena. O balanço energético corporal pode ser alterado através de hábitos alimentares, exercícios físicos, constituição genética, além de aspectos sociais, culturais e psicológicos do indivíduo (GOODMANN et al, 2006; RANG et al, 2007). Vários estudos propuseram o mecanismo de regulação do balanço energético e dos depósitos de gordura. Em 1994, foi clonado o gene ob, cuja mutação provoca a obesidade. A leptina, conteúdo protéico desse gene, foi associada à redução de peso. A insulina e peptídeos hipotalâmicos também exercem um papel importante na regulação do peso corporal (RANG et al, 2007). Há uma miscelânea de riscos inerentes à obesidade. Essa enfermidade crônica pode trazer como conseqüências o aparecimento ou o agravamento de comorbidades, tais como: diabete melito não insulino-dependente, hipertensão, hipertrigliciridemia, cardiopatia isquêmica, câncer de cólon, de mama, de próstata, de vesícula biliar, de ovário e de útero. Também podem ocorrer distúrbios como osteoartrite, doença vesicular, hiperuricemia, hipogonadismo masculino e síndrome plurimetabólica (FUCHS et al, 2004; GOODMANN et al, 2006; RANG et al, 2007; WHO, 2006 a). 14 ____ 3.2 TERAPÊUTICA PARA A OBESIDADE 3. Revisão Bibliográfica Embora alterações na dieta e no estilo de vida constituam as principais terapias recomendadas para a obesidade, a perda de peso é, freqüentemente, baixa e em longo prazo é desestimulante ao paciente. Essa terapia apresenta demora no surgimento de efeitos, além de exigir um elevado grau de comprometimento do indivíduo obeso (BLANCK et al, 2004; CHAPUT e TREMBLAY, 2006). Considerando os riscos inerentes à obesidade, há a nítida necessidade em tratar o paciente, não apenas com a finalidade estética, mas também, e principalmente, devido aos danos causados à saúde. A terapia de escolha varia conforme a classificação da patologia no paciente, sendo priorizada para as situações de sobrepeso apenas exercícios físicos e esquemas dietéticos, ambos orientados por profissional competente. Tratamentos para casos mais graves, de indivíduos classificados como obesos, requerem uma interferência farmacológica e/ou cirúrgica e, certamente, devem ser associados à dieta e atividade física (RANG et al, 2007; USP DI, 2005). Os principais fármacos disponíveis para o tratamento da obesidade são divididos em dois grupos: estimulantes do SNC, os quais atuam no mecanismo central das catecolaminas, e fármacos que interferem na via serotoninérgica. Estimulantes, como as anfetaminas, são pouco recomendados para tratamentos em longo prazo devido aos seus efeitos potenciais aditivos. Outros estimulantes que têm sido amplamente utilizados incluem: cloridrato de anfepramona, cloridrato de femproporex e mazindol (PARFITT, 1999). Uma classificação dos medicamentos que atuam no SNC e por outros mecanismos é apresentada no Quadro 2. Entre essas classes, destacam-se os anorexígenos, também chamados de “supressores de apetite” ou “inibidores de apetite”. Seu uso é indicado apenas como adjuvante no tratamento da obesidade, devido aos efeitos colaterais característicos (KOROLKOVAS et al, 2007). 15 ____ 3. Revisão Bibliográfica Quadro 2. Classificação dos principais fármacos para perda de peso, de acordo com o respectivo mecanismo de ação (FUCHS et al, 2004). Mecanismo de Ação Fármacos cloridrato de anfepramona (dietilpropiona) Catecolaminérgico cloridrato de femproporex mazindol Catecolaminérgico e serotoninérgico cloridrato de sibutramina leptina Hormônios e peptídeos colecistoquimina agentes relacionados ao neuropeptídeo Y agonistas β3-adrenérgicos Inibidor da absorção de gordura orlistate (tetraidrolistatina) quitosana aminofilina Termogênico cafeína cloridrato de efedrina teobromina Sendo aminas simpatomiméticas, os efeitos da maioria dos anorexígenos são semelhantes às anfetaminas, incluindo estimulação do SNC e elevação da pressão arterial. Muitos desses fármacos possuem um efeito principal sobre o centro de controle do apetite no hipotálamo. A redução da ingestão de alimentos ocorre por alteração no controle químico da transmissão do impulso nervoso (KOROLKOVAS et al, 2007). Muitos dos medicamentos anorexígenos são comercializados em todo o mundo. Alguns deles, porém, são proibidos em todos ou em alguns países. O femproporex, por exemplo, não é aprovado para uso nos Estados Unidos e em parte da Europa devido à ausência de estudos (FDA, 2006). Entre a classe de anorexígenos, a sibutramina e o orlistate são os medicamentos com maior número de estudos (CHAPUT e TREMBLAY, 2006). No 16 ____ 3. Revisão Bibliográfica entanto, para tratamentos a longo prazo são necessárias mais pesquisas (LI et al, 2005; RANG et al, 2007). Existem também muitos produtos para o tratamento da obesidade, não reconhecidos como fármacos. Entre esses, encontram-se misturas de produtos naturais ou suplementos alimentares, com propostas de efeitos diferenciados e reações adversas menos graves. Com esses apelos, freqüentemente, aqueles produtos são erroneamente divulgados pelos fabricantes de forma indutora à automedicação (ALLISON et al, 2001; ANFARMAG, 2006). Muitas vezes, as formulações prescritas para o emagrecimento são excêntricas e incluem associações de fármacos e outros produtos dotados de finalidades terapêuticas diversas. São comuns as formulações compostas de diuréticos, laxantes, digitálicos, antidepressivos, calmantes, estimulantes do hormônio da tireóide e redutores do apetite (KOROLKOVAS et al, 2007). Para a maioria dos pacientes, não é justificado o uso dessas terapias alternativas simultaneamente. A perda de peso proporcionada, nesses casos, é consideravelmente rápida e não saudável. Essas associações, com finalidade exclusiva de tratamento da obesidade, são vedadas pela ANVISA. Às farmácias, cabe o papel de rejeitar as receitas cujo padrão legal não é respeitado, contribuindo assim para o uso racional de medicamentos no tratamento da obesidade (BRASIL, 2007 a). Alguns fármacos já aprovados pelo FDA para outras patologias estão sendo avaliados para a redução de peso, tais como o rimonabanto e a zonizamida (FINER, 2005; LI et al, 2005). Entretanto, existem poucas pesquisas para a predição de sua eficácia no tratamento da obesidade. Outras substâncias também estão sendo desenvolvidas, como análogos do antidepressivo fluoxetina ou outros que tenham a capacidade de reduzir a massa corporal sem restrição dietética, com especificidade e com poucos efeitos colaterais (BHANDARI et al, 2006; CHAPUT e TREMBLAY, 2006). 17 ____ 3.3 CLORIDRATO DE SIBUTRAMINA 3. Revisão Bibliográfica 3.3.1 Aspectos gerais No início da década de 80, o cloridrato de sibutramina monoidratado foi sintetizado pela indústria Abbott como inibidor da recaptação de serotonina e de norepinefrina. Embora a molécula não tenha apresentado eficácia como antidepressivo, proposta para a qual foi inicialmente desenvolvida, demonstrou atividade para a redução do apetite (CHAPUT e TREMBLAY, 2006). O primeiro depósito de patente para o cloridrato de sibutramina monoidratado pela Abbott ocorreu na Europa, em 1985, sob registro GB 8531071. A patente foi depositada no Brasil apenas em 1996, sob o número de registro PI 1100069-4 (ABBOTT, 1996). Nesse país, a Abbott também concedeu a comercialização do medicamento à Medley (BVS, 2006). Conforme a lei de patentes (BRASIL, 1996) a patente da Abbott estaria expirada em 2005. No entanto, através de uma ação judicial a Abbott recebeu permissão para a exclusividade de comercialização de composições farmacêuticas contendo sibutramina no Brasil até dezembro de 2006 (ABBOTT, 2006 a). Atualmente, com a expiração do período legal de patente, o cloridrato de sibutramina está disponível para a fabricação de medicamentos industrializados ou manipulados. Após 1997, a utilização do fármaco foi aprovada pelo FDA para a redução de peso (PR Vade Mécum, 2005; RANG et al, 2007). A sibutramina é uma substância de controle especial (BRASIL, 1998; BRASIL, 2007 c), apresentada na forma de cloridrato monoidratado (BUDAVARI, 2001). 3.3.2 Aspectos físico-químicos A estrutura básica da sibutramina (Figura 1) é a ciclobutanometenamina (USP DI, 2005). Seus nomes químicos são cloridrato de N-(1-[1-(4-clorofenil)ciclobutil]-3- 18 ____ metilbutil)-N,N-dimetilamina monoidratado ou 3. Revisão Bibliográfica 1-(4-clorofenil)-N,N-dimetil-α-(2- metilpropil) ciclobutanometamina (BUDAVARI, 2001). CH2 H *C CH(CH3)2 N(CH3)2 .HCl Cl Figura 1. Estrutura química do cloridrato de sibutramina. *Carbono quiral. No Quadro 3 são apresentados dados para cada forma de apresentação química da sibutramina. O coeficiente de partição octanol:água do cloridrato de sibutramina é de 30,9, em pH 5 (BUDAVARI, 2001). O cloridrato de sibutramina é um sal de amina terciária, possuindo, portanto, características de bases (SOLOMONS e FRYHLE, 2005). O pKa estimado para o cloridrato de sibutramina é de 9,6 (VCCLAB, 2007). Quadro 3. Dados referentes ao registro e molécula das formas de apresentação da sibutramina. FORMA DADOS Registro no CAS1,2 Número DCB1 Fórmula molecular2 Massa molecular2 sibutramina anidra 106650-56-0 07984 C17H26ClN 279,86 cloridrato de sibutramina 84485-00-7 07985 C17H26ClN.HCl 316,36 cloridrato de sibutramina monoidratado 125494-59-9-9 09375 C17H26ClN.HCl.H2O 334,33 Fonte: 1-BRASIL, 2006 a; 2-BUDAVARI, 2001. 19 ____ 3. Revisão Bibliográfica A sibutramina possui um centro estereogênico, resultando na existência de dois enantiômeros (FANG et al, 1999). É comercializada na forma de racemato, porém a forma R é mais potente (ABBOTT, 2006 b; GLICK et al, 2000; MEDLEY, 2006). Os enantiômeros S da sibutramina e de seus metabólitos pareceram contribuir mais para a ocorrência de efeitos colaterais em ratos (GLICK et al, 2000; RADHAKRISHNA et al, 2000). Já existem métodos descritos para a síntese assimétrica da forma de Rsibutramina (HAN et al, 2006) e R-desmetilsibutramina (FANG et al, 1999; HAN et al, 2002). 3.3.3 Aspectos terapêuticos 3.3.3.1 Formulações farmacêuticas A primeira forma farmacêutica para o cloridrato de sibutramina foi desenvolvida pela Abbott. O medicamento denominado Meridia® é comercializado até os dias atuais na Europa, nos Estados Unidos e em outros países (USP DI, 2005). As especialidades farmacêuticas disponíveis no Brasil são Plenty® (Medley) e Reductyl® (Abbott). Ambos os medicamentos são apresentados em caixas contendo 10 ou 30 cápsulas de 10 ou 15 mg (ABBOTT, 2006 b; MEDLEY, 2006). 3.3.3.2 Indicações e efeitos A indicação de uso da sibutramina é no manejo da obesidade, geralmente em pacientes com IMC superior a 30 kg/m2. Seu uso também é permitido para tratamentos de sobrepeso em indivíduos com IMC entre 27 e 30, mas que apresentem fatores de risco associados, tais como hipertensão, diabetes e dislipidemia (USP DI, 2005). 20 ____ 3. Revisão Bibliográfica Vários estudos prospectivos, randomizados e controlados comprovaram a eficácia do cloridrato de sibutramina para a perda de peso (THEARLE e ARONNE, 2003). Entre esses, uma análise foi realizada com pacientes tratados com sibutramina durante um ano versus placebo. Demonstrou-se uma perda de peso 4,6% maior nos pacientes que receberam o tratamento em relação ao grupo placebo (JAMES et al, 2000). A sibutramina também reduz a gordura visceral e melhora o controle glicêmico e lipídico (FUJIOKA et al 2000; RANG et al 2007). Estudo realizado com 605 pacientes demonstrou que após a administração de 10 mg diários de sibutramina durante seis meses, houve a redução dos níveis plasmáticos de triglicerídeos e lipoproteínas de densidade muito baixa (VLDL), enquanto houve aumento de lipoproteínas de alta densidade (HDL) (JAMES et al, 2000). Numa avaliação realizada com culturas de células musculares de ratos (BAILEY et al, 2001) e em humanos (KIM et al, 2004), os metabólitos da sibutramina apresentaram aumento da recaptação da glicose insulino-dependente. Em ambos os estudos, concluiu-se que a administração de sibutramina facilita o transporte de glicose. Outra vantagem desse anorexígeno é não reduzir a libido em mulheres, como ocorre com outros inibidores da recaptação de serotonina (KIM et al, 2006). 3.3.3.3 Posologia A sibutramina apresenta significante relação dose-efeito (JAMES et al, 2000; WEINTRAUB et al, 1991). Geralmente, é utilizada nas doses de 10 mg ou 15 mg uma vez ao dia preferentemente pela manhã. Pacientes que não toleram essas doses podem administrar 5 mg (PARFITT, 1999; USP DI, 2005). A duração do tratamento até uma redução significativa de peso é de aproximadamente quatro semanas (PR Vade Mécum, 2005). 21 ____ 3.3.3.4 Toxicologia e Abuso 3. Revisão Bibliográfica Sobredoses de sibutramina de duas a cinco vezes acima da dose usual (25 a 75 mg), quando comparados com 20 mg do psicoestimulante D-anfetamina, não apresentaram riscos pronunciados. Com uma administração da dose de 75 mg foram observadas ansiedade e confusão (SCHUH et al, 2000). Caso ocorra sobredose, deve ser feito o monitoramento das funções respiratórias e cardíacas e do estado de outros sinais vitais (PR Vade Mécum, 2005). Há um relato de caso em que uma mulher ingeriu uma dose de 400 mg de sibutramina. Observou-se um aumento da freqüência cardíaca (USP DI, 2005). Devido ao possível efeito da sibutramina no aumento do transporte de glicose para os músculos, ocorreram casos de contaminação proposital de suplementos para atletas com esse fármaco. Quando há diminuição do transporte de glicose no músculo ocorre retardo do consumo de glicogênio e, conseqüentemente, há dor e fadiga muscular no atleta. Assim, esses casos foram considerados dopping e os atletas foram impedidos da participação em competições esportivas (ANVISA, 2007). 3.3.3.5 Mecanismo de ação O mecanismo de ação da sibutramina está envolvido com a inibição da recaptação de serotonina (5-HT), de norepinefrina (PR Vade Mécum, 2005; USP DI, 2005) e de dopamina em menor grau (BALCIOGLU e WURTMAN, 2000). Há indícios de que a potencialização do efeito da serotonina (receptores HT2A/2C) e da norepinefrina (β 1) em nível central é responsável pela sensação de saciedade, enquanto que o efeito sobre os receptores noradrenérgicos periféricos (β 3) provoca um aumento no gasto calórico por aumento da taxa metabólica (PR Vade Mécum, 2005). Testes in vitro demonstraram que o cloridrato de sibutramina é menos potente que os seus dois metabólitos principais. Assim, as suas ações farmacológicas são devidas, predominantemente, aos metabólitos ativos formados por sua desmetilação (USP DI, 2005). 22 ____ 3. Revisão Bibliográfica Alguns estudos sugerem que a sibutramina reduz o peso corporal por diminuição da ingestão de calorias e aumento do consumo de energia (HANSEN et al, 1998; LIU et al, 2002; ROLLS et al, 1998). Esse fármaco não promove liberação de serotonina para os nervos terminais. Assim, a sibutramina apresenta a vantagem de não causar disfunção da válvula cardíaca e hipertensão pulmonar primária, como ocorre com os demais fármacos anorexígenos (KOROLKOVAS et al, 2007; USP DI, 2005). 3.3.3.6 Farmacocinética Dados obtidos de indivíduos normais e pacientes obesos demonstraram que, após administração oral, a sibutramina é rapidamente absorvida (77%). Sua distribuição nos tecidos corporais também é rápida e extensa (GOODMANN, 2006; USP DI, 2005) Esse fármaco sofre intensa biotransformação pré-sistêmica, principalmente através da isoenzima CYP 3A4. Há formação de dois metabólitos ativos (Figura 2): Nmonodesmetilsibutramina (amina secundária, metabólito 1) e N-di- desmetilsibutramina (amina primária, metabólito 2). Esses são hidroxilados e depois de conjugados se tornam metabólitos inativos, sendo eliminados através da via renal. A ligação da sibutramina às proteínas plasmáticas é de 97% e a dos seus dois metabólitos ativos é de 94% (GOODMANN et al, 2006; KOROLKOVAS et al, 2007; PARFITT, 1999; USP DI, 2005). A concentração plasmática máxima é obtida após 1,2 horas de administração do fármaco, enquanto a sua meia-vida é de 1,1 horas. Para os metabólitos 1 e 2, a concentração máxima é atingida em 3 horas, com a meia-vida de eliminação de 14 e 16 horas, respectivamente (ABBOTT, 2006; KOROLKOVAS et al, 2007; PARFITT, 1999; USP DI, 2005). 23 ____ 3. Revisão Bibliográfica CH2 H *C CH(CH3)2 NHCH3 CH2 H *C CH(CH3)2 NH2 Cl I Cl II Figura 2. Estruturas químicas de: metabólito 1 (I) e metabólito 2 (II). Em 18 pacientes obesos, após uma dose unitária de 15 mg de fármaco, a média dos picos das concentrações plasmáticas dos metabólitos 1 e 2 foram de 4 ± 0,8 ng/mL e 6,4 ± 0,8 ng/mL, respectivamente. Nesse mesmo estudo, provou-se que problemas na função renal não alteram significativamente a concentração plasmática máxima, tempo de meia-vida, e a área sob a curva (ASC) do fármaco ou de seus metabólitos ativos (USP DI, 2005). Entretanto, há recomendações de cautela quando for administrado em nefropatas (KOROLKOVAS et al, 2007). Quando ingerida junto com alimentos aumenta o tempo para atingir o pico de concentração plasmática em três horas e reduz as concentrações plasmáticas dos metabólitos em 30%, mas não afeta a ASC (GOODMANN et al, 2006; USP DI, 2005). As concentrações plasmáticas máximas e ASC são levemente maiores em mulheres do que em homens, mas isso não é clinicamente significante. Assim, não é necessário ajuste de dose (USP DI, 2005). A grande maioria dos estudos para a sibutramina é na sua forma de cloridrato monoidratado. Um estudo comparou o mesilato de sibutramina hemiidratado com cloridrato de sibutramina monoidratado, através de cada ASC e afirma que ambos são farmacocineticamente equivalentes (PARK et al, 2004). 3.3.3.7 Precauções e contra-indicações Nenhuma evidência de carcinogenicidade e mutagenicidade foi verificada em fêmeas de ratos ou camundongos. Também 24 não houve evidências de ____ 3. Revisão Bibliográfica teratogenicidade em avaliações com ratas prenhas, quando administrada numa dose correspondente a uma ASC 43 vezes superior à dose normal para uso humano (USP DI, 2005). Estudos realizados com ratos demonstraram não haver problemas de fertilidade com a administração de sibutramina. No entanto, não há dados epidemiológicos que averigúem a interferência da sibutramina na gestação. As distribuições do fármaco ou seus metabólitos no leite materno são desconhecidas (USP DI, 2005). Considerando a escassez ou ausência de estudos para grupos especiais de pacientes, a sibutramina está contra-indicada para: pacientes que apresentem hipersensibilidade a ela, gestantes, lactantes, crianças e adolescentes até 18 anos, idosos acima de 65 anos, hipertensão moderada a grave, consumo de álcool (KOROLKOVAS et al, 2007; USP DI, 2005) e pacientes com antecedentes de anorexia nervosa ou bulimia nervosa (PARFITT, 1999; PR Vade Mécum, 2005). Aconselha-se que o paciente usuário do fármaco não conduza veículos ou opere máquinas pesadas (PARFITT, 1999; PR Vade Mécum, 2005). 3.3.3.8 Interações medicamentosas Embora a ligação às proteínas plasmáticas seja muito elevada, interações com outros fármacos com essa mesma característica não são comuns. Esse fato é justificado devido à baixa dose do cloridrato de sibutramina (USP DI, 2005). Além disso, as características básicas da sibutramina e de seus metabólitos ativos dificultam a ligação à albumina, principal proteína plasmática à qual se ligam fármacos ácidos (varfarina, antiinflamatórios não-esteróides e sulfonamidas). Assim, a sibutramina pode se ligar às proteínas com características ácidas, que estão em menor quantidade no plasma, sem competir pela ligação com fármacos ácidos (RANG, 2007). Há interações do cloridrato de sibutramina com inibidores da recaptação da monoaminoxidase (PARFITT, 1999; SCHUH et al, 2000), devendo ser respeitado um 25 ____ 3. Revisão Bibliográfica prazo de 14 dias entre as administrações deles (KOROLKOVAS et al, 2007; USP DI, 2005). O uso concomitante da sibutramina com outros fármacos dotados de ação no SNC também provoca uma interação perigosa (KOROLKOVAS et al, 2007). Inibidores da recaptação de serotonina, por exemplo, associados à sibutramina aumentam o risco da síndrome serotoninérgica, incluindo sintomas como agitação, diaforese, perda da coordenação, alterações em nível mental, entre outros (PARFITT, 1999; USP DI, 2005). Se o uso combinado desses medicamentos não puder ser evitado, o paciente deve ser monitorado cuidadosamente para avaliar o aparecimento dos efeitos adversos (TATRO, 2006). Fármacos que inibem o citocromo P450 podem interferir no efeito farmacológico da sibutramina. O cetoconazol e a eritromicina inibem o metabolismo hepático da sibutramina, pois provocam a inibição da isoenzima CYP 3A4 do citocromo P450. Já a cimetidina não modifica a eliminação de sibutramina em grau clinicamente significativo (PARFITT, 1999; PR Vade Mécum, 2005; USP DI, 2005). O efeito da sibutramina pode ser reduzido se administrado simultaneamente com antagonistas adrenérgicos como o metoprolol e prazosina ou com antagonistas serotoninérgicos como a metergolina e ritanserina (KOROLKOVAS et al, 2007). 3.3.3.9 Reações adversas As reações adversas comumente relatadas para a sibutramina são: boca seca, cefaléia, insônia, sonolência, constipação, vertigens e rinite (PARFITT, 1999; USP DI, 2005). Também há suspeitas de amnésia causadas pela sibutramina (CLARK e WOOLRYCH, 2004). Menos freqüentemente são reportados dismenorréia, edema, sintomas semelhantes a resfriados, depressão, rubor, calor, taquicardia, dispnéia, sudorese e alterações do paladar. Em geral, estes efeitos cedem com o tempo e não requerem suspensão do tratamento (PARFITT, 1999; PR Vade Mécum, 2005). O uso do fármaco pode reduzir ou inibir o fluxo salivar, contribuindo para o desenvolvimento de cáries dentárias, doença periodontal, candidíase oral e desconforto (PARFITT, 1999; USP DI, 2005). 26 ____ 3. Revisão Bibliográfica Alguns anorexígenos causam sérios efeitos como disfunção da válvula cardíaca e hipertensão pulmonar, devidos à liberação de serotonina para os nervos terminais. Já que o cloridrato de sibutramina é rapidamente transformado em seus metabólitos, esse efeito não poderia ser esperado (USP DI, 2005). Para comprovar tal hipótese, estudos relacionados àquela possível reação adversa foram conduzidos para avaliar o comportamento da sibutramina. Não foram observadas alterações significativas na pressão sangüínea e na ta xa de batimentos cardíacos de adultos hipertensos ou normotensos. Ainda assim, a pequena variação dessas medidas leva à recomendação de que seja realizado um monitoramento adequado do paciente (GURSOY et al, 2005; MCMAHON et al, 2002; PARFITT, 1999). Quando o tratamento do paciente consiste na associação da administração de sibutramina com exercícios físicos e dieta alimentar, a eficácia para a redução de peso e segurança quanto aos riscos cardioestimulantes são pronunciadas (BERUBÉ-PARENT et al, 2001). A avaliação da segurança e eficácia para o uso de sibutramina em indivíduos menores de 16 anos ou acima de 61 anos ainda não está completamente estabelecida. Entretanto, não há problemas relatados até o momento em indivíduos de 61 a 77 anos, com uma dose diária de 15 mg (USP DI, 2005). Um total de 498 adolescentes obesos foi randomicamente dividido para receber uma dose de sibutramina 10 mg ou placebo. Como resultado, observou-se redução significativa do peso corpóreo e os efeitos colaterais foram semelhantes aos já reportados para adultos. O tratamento com sibutramina para essa população demonstrou mínimos efeitos cardiovasculares (DANIELS et al, 2007). 3.3.4 Determinação em fluidos biológicos A sibutramina e seus metabólitos N-desmetilados foram determinados simultaneamente em plasma humano (Quadro 4), por CLAE e detecção por espectrometria de massas (CHEN et al, 2003; DING et al, 2003; HIND et al, 1999). 27 ____ 3. Revisão Bibliográfica Quadro 4. Comparação das condições gerais empregadas para determinação de sibutramina e seus metabólitos em plasma humano, por CLAE. Condição Coluna CHEN et al, 2003 Waters Xterra MS C18 500 x 2,1 mm; 3,5 µm ACN (contendo 0,1% de ácido trifluoroacético) – ácido trifluoroacético 0,1% 55:45 (V/V) Espectrômetro de massas, com sistema ion trap 5 µL sibutramina metabólito 2 cloridrato de propranolol DING et al, 2003 Hypersil ODS-2 C18 4,6 x 250 mm; 5 µm Tampão acetato de amônio 10 mM pH 3,5 – metanol 25:75 (V/V) Espectrômetro de massas - ESI 50 µL sibutramina metabólito 1 metabólito 2 cloridrato de fenilpropanolamina HIND et al, 1999 Hypersil BDS C8 Fase Móvel Tampão acetato de amônio 0,2 M – ACN 50:50 (V/V) Detecção Volume de Injeção Substâncias Quantificadas Padrão Interno Espectrômetro de massas 10 µL metabólito 1 metabólito 2 - 3.3.5 Controle de qualidade Nas farmácias, as matérias-primas sólidas devem ser analisadas, no seu recebimento, efetuando-se, no mínimo, os testes qualitativos: caracteres organolépticos, solubilidade, pH, peso e ponto (ou faixa) de fusão. Podem ser aceitos os demais ensaios farmacopéicos realizados pelos fabricantes/fornecedores desde que esses estejam qualificados pela farmácia (BRASIL, 2007 b). Uma exigência legal para o monitoramento do processo magistral é a determinação do teor e/ou uniformidade do conteúdo do produto acabado, em casos específicos e com periodicidade estabelecida. É permitida a realização dessas análises em laboratórios terceirizados. Entretanto, muitos métodos requerem aparelhagem disponível no próprio laboratório da farmácia, além de possuírem um custo reduzido. Assim, sua realização deve ser incentivada, a fim de agilizar o processo de garantia da qualidade do serviço prestado (BRASIL, 2007 b). 28 ____ 3. Revisão Bibliográfica Nas indústrias farmacêuticas, antes que as matérias-primas sejam liberadas para uso, o responsável pelo controle de qualidade deve garantir que as mesmas sejam testadas quanto à conformidade em relação às especificações de identificação, pureza, teor e outros parâmetros de qualidade. Além disso, é realizado o controle em processo e do produto acabado (BRASIL, 2003 c). Apesar do consumo elevado, tanto de cápsulas industrializadas quanto de cápsulas manipuladas, a monografia do cloridrato de sibutramina monoidratado ainda não consta em farmacopéias (BP 2007; F. Bras. IV, 2006; Ph. Eur., 2008; USP 31, 2008; WHO, 2004). A USP 31 (2008) publicou uma lista de fármacos e produtos farmacêuticos, cujas monografias são prioridades para inclusão nas próximas edições, considerando o fato de suas patentes terem sido extintas recentemente. Para o cloridrato de sibutramina, já foi submetida uma monografia para a matéria-prima, mas não para a forma farmacêutica cápsulas. A determinação de sibutramina foi validada por CLAE, através de dois métodos isocráticos (RADHAKRISHNA et al, 2000). Em 2005, XIAO e colaboradores desenvolveram método de separação quiral por CLAE, para os enantiômeros da sibutramina. No Quadro 5 são apresentadas as condições cromatográficas utilizadas nessas determinações. Foi proposto um método espectrofotométrico na região do UV/Visível, através da formação de um complexo corado específico da sibutramina com vermelho do congo. O método pode ser aplicado para determinação do teor de sibutramina em cápsulas (QIN et al, 2006). A determinação de sibutramina em cápsulas, na presença de seus produtos de degradação induzidos oxidativamente, foi validada por CLAE. Para tanto, foi utilizada Coluna C18 Varian Microsorb-MV 100Å, com dimensões 25 cm x 4,6 mm e poros 5 µm. A fase móvel constou de metanol:água:trietilamina 80:20:0,3 (V/V/V) e o pH foi ajustado para 4,5 com ácido fosfórico. Foi utilizado detector de ultravioleta em 225 nm (SEGALL et al, 2003). 29 ____ 3. Revisão Bibliográfica Quadro 5. Comparação das condições gerais empregadas para determinação de sibutramina e seus enantiômeros em matéria-prima, através de CLAE. RADHAKRISHNA et al, 2000 Condição Método quiral Coluna quiral OD 250 x 4,6 mm; 10 µm XIAO et al, 2005 Método A Hypersil C18 BDS 250 x 4,6 mm; 5µm Tampão hidrogeno-fosfato de amônio 0,05 M pH 6 – ACN 35:65 (V/V) Método B Partisphere C18 250 x 4,6 mm; 5µm Coluna Coluna não-quiral C Fase Móvel Hexano – etanol – ácido trifluoracético 93:7:0,05 (V/V/V) Água (contendo 1% trietilamina pH 6,0) – ACN 30:70 V/V Metanol – água (10:90 V/V) contendo 0,8 mmol/L de β-ciclodextrina pH 3,6 NC* sibutramina nas formas R e S Não especificado Matéria-prima e seus enantiômeros Detecção Substâncias Analisadas Padrão Forma NC*: não consta. UV 225nm com DAD sibutramina nas formas R e S Matéria-prima e seus enantiômeros UV 225 nm UV 225 nm sibutramina 4-cloro-anilina Matéria-prima sibutramina lovastatina Matéria-prima Para que um método seja considerado adequado para a análise de determinada amostra é necessária a sua validação. São exigidos vários parâmetros para a avaliação do método, os quais variam de acordo com o equipamento utilizado (ICH, 2005). 3.3.6 Estabilidade A estabilidade de um medicamento é a extensão na qual um produto mantém, dentro de limites especificados, durante o período de armazenamento e uso, as mesmas propriedades e características que possuíam no momento da sua fabricação (USP 30, 2007). 30 ____ 3. Revisão Bibliográfica Fármacos degradados podem resultar em situações indesejáveis para o usuário, tais como: perda ou diminuição da potência, aumento da atividade, geração de efeitos tóxicos ou colaterais (TONNESEN, 1991; TONNESEN, 2001). Por estes motivos, as farmacopéias (BP 2007; F. Bras. IV, 1988; F. Bras. IV, 2006; Ph. Eur., 2005; USP 30, 2007) e PARFITT (1999) descrevem quanto ao armazenamento de cada fármaco, em sua respectiva monografia: “manter ao abrigo da luz” as substâncias fotolábeis; “manter sob refrigeração” ou “manter em local fresco” as substâncias termolábeis; “manter em local seco” as substâncias lábeis à umidade, entre outras recomendações. A presença de energia luminosa sobre moléculas de fármacos, por exemplo, pode catalisar a ocorrência de reações de decomposição fotoquímica (NUDELMAN, 1975), por motivos como oxidação (fotoxidação), cisão (fotólise) de ligações covalentes ou isomerização fotoinduzida, e também alterar o tempo de validade da formulação (TONNESEN, 2001, USP 30, 2007). A velocidade dessa reação fotoquímica depende da intensidade e do comprimento de onda da luz incidente, além do tamanho, forma, composição e cor da embalagem do medicamento (LACKMAN, 1986; TONNESEN, 2001). Vários fatores ambientais influenciam na estabilidade, como temperatura, umidade e luz. Outros que contribuem, relacionados ao próprio produto são: propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e excipientes farmacêuticos, forma farmacêutica e sua composição, processo de fabricação, tipo e propriedades dos materiais de embalagem (BRASIL, 2005 b). Assim, é primordial o conhecimento do grau de estabilidade de fármacos e medicamentos, que envolvem uma série de análises laboratoriais e estatísticas. Existem guias oficiais para a avaliação da estabilidade de fármacos e produtos novos. Essas preconizam a realização de estudos de degradação acelerada, com condições de estresse padronizadas para a exposição à luz ultravioleta, temperatura e umidade (ICH, 1996; ICH, 2003). Além desses, são preconizados estudos de estabilidade de acompanhamento e de longa duração (BRASIL, 2005 b). 31 ____ 3. Revisão Bibliográfica Não existem relatos de estudos de estabilidade para o cloridrato de sibutramina monoidratado. Existem apenas avaliações da especificidade, frente a condições de estresse, na validação de técnicas por CLAE (RADHAKRISHNA et al, 2000; SEGALL et al, 2003). Considerando-se o risco de indústrias e farmácias magistrais manusearem e armazenarem esta substância em condições ambientais indevidas salienta-se a importância do conhecimento da estabilidade de tal fármaco, conforme já foi evidenciado para outros fármacos (BANSAL et al, 2007; MARTINS et al, 2004; OMARI et al, 2007; TONNESEN, 2001). 32 4. MATERIAL E MÉTODOS ___________________________________________________________________ __ 4. Material e Métodos A maior parte do presente trabalho foi realizada no Laboratório de Química Farmacêutica (LAPPS), desta Faculdade. Algumas análises foram desenvolvidas em outros laboratórios, os quais estão descritos no decorrer do trabalho. Os métodos analíticos empregados neste trabalho foram aqueles já consagrados e utilizados em farmacopéias, além de condizentes com a sua aplicação em farmácias magistrais. 4.1 SUBSTÂNCIA QUÍMICA DE REFERÊNCIA E AMOSTRAS Quatro lotes de cloridrato de sibutramina monoidratado (SQR com teor 99,92%, SIB1, SIB2 e SIB3) foram adquiridos de fornecedores de insumos farmacêuticos, através de uma farmácia magistral. Essas matérias-primas também foram provenientes de diferentes origens (Quadro 6). Todas vieram acompanhadas de certificado de análise do fornecedor. Quadro 6. Características das a mostras de matérias-primas de cloridrato de sibutramina monoidratado utilizadas no presente trabalho. CÓDIGO SQR SIB1 SIB2 SIB3 ORIGEM Índia China China China FORNECEDOR SP Farma Gerbrás Opção Fênix DEG LOTE 080903.146 060310SIBU-HCl L167794 IF061108 DATA VAL. 09/2008 03/2008 05/2009 11/2009 Também foram utilizadas cápsulas industriais (CAP) do medicamento referência Reductil®, da Abbott, com lote 440398F04 e validade 08/2008. Esse produto contém 15 mg de cloridrato de sibutramina monoidratato e os excipientes utilizados pelo fabricante são: celulose microcristalina, dióxido de silício, estearato de magnésio e lactose. 35 __ 4.2 ANÁLISE QUALITATIVA 4. Material e Métodos 4.2.1 Descrição A SQR e as amostras SIB1, SIB2 e SIB3 do cloridrato de sibutramina foram avaliadas sensorialmente quanto ao aspecto, cor e odor. 4.2.2 Solubilidade Avaliou-se a solubilidade para a SQR e para a amostra de matéria-prima SIB1, frente a diferentes solventes. Os solventes testados foram: água; metanol; etanol; N,N-dimetilformamida; acetato de etila; éter etílico; ácido clorídrico 0,1 M e hidróxido de sódio 0,1 M . O teste de solubilidade foi conduzido à temperatura ambiente (25 ± 1 °C). Adicionaram-se volumes crescentes de cada solvente sobre o fármaco, mediante agitação, até a sua completa solubilização. A classificação de solubilidade foi determinada de acordo com a F. Bras.IV (1988). 4.2.3 Determinação do pH em solução Para a determinação do pH da SQR e da amostra SIB1, foi utilizado um potenciômetro da marca Denver, modelo Ultra Basic UB-10, com compensação automática de temperatura. Acoplou-se a esse um eletrodo de vidro-calomelano pH/ATC. O equipamento foi previamente aferido com as soluções tampão de pH 7,0 e pH 4,0, nessa ordem. Mediram-se os pH das soluções aquosas do fármaco a 2%. Para tanto, foram preparadas três soluções de SQR e de SIB1, respectivamente, e a determinação foi realizada em triplicada para cada uma delas. 36 __ 4.2.4 Determinação da faixa de fusão 4. Material e Métodos A faixa de fusão foi determinada em triplicata para a SQR e SIB1. Paralelamente, uma calibração de cada equipamento foi conduzida mediante análise de uma substância padrão, a dicianodiamina (WHO), com ponto de fusão correspondente a 210 °C. A taxa de aquecimento foi de 10 ºC por minuto até atingir a temperatura de 10 °C abaixo do início da faixa de fusão prevista para o fármaco. Após essa temperatura, a taxa foi ajustada para 1 ºC por minuto, conforme estabelecido na F. Bras. (1988). Nas condições citadas, foram usados dois equipamentos de modelos diferentes: o equipamento Mettler Toledo, modelo FP90, e o equipamento de bloco metálico aquecido, segundo Koffler. Os procedimentos foram realizados em triplicata para cada amostra. Os resultados de faixa de fusão obtidos nos dois equipamentos foram comparados entre si, com os da DSC e com os emitidos no certificado de análise dos fornecedores. 4.2.4.1 Equipamento Mettler Toledo, modelo FP90 As substâncias para análise (SQR e SIB1) foram inseridas em tubos capilares até uma altura de 0,5 cm. Assim, foram acopladas e analisadas no equipamento. A leitura da faixa de fusão foi determinada automaticamente pelo aparelho. 4.2.4.2 Equipamento de bloco metálico aquecido, segundo Koffler Algumas partículas das substâncias (SQR e SIB1) foram dispostas em uma fina camada, entre lâmina e lamínula. Este conjunto foi adaptado ao bloco metálico aquecido do aparelho da marca Reichert. O aquecimento foi realizado por um 37 __ 4. Material e Métodos reostato e a temperatura foi controlada por um termômetro acoplado à placa metálica. A fusão dos cristais foi observada com auxílio de microscópio. 4.2.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) A SQR e todas as amostras de matéria-prima (SIB1, SIB2 e SIB3) foram submetidas à análise por DSC, com fluxo de calor. Pesou-se exatamente de 1 a 2 mg de cada amostra em um porta-amostra de alumínio, o qual foi posteriormente tampado e selado em selador adequado. Esse conjunto foi adaptado em um calorímetro diferencial de varredura Shimadzu da série DSC-60. O equipamento foi acoplado a um aplicativo Thermal Analyser TA-60WS e a um controlador de fluxo FC-60A. O equipamento foi previamente calibrado com índio e zinco. Como referência, foi utilizado um porta -amostra vazio. Os parâmetros experimentais utilizados são informados no Quadro 7. Quadro 7. Especificações dos parâmetros experimentais utilizados na calorimetria exploratória diferencial às quais as amostras e SQR foram submetidas. Parâmetro faixa de aquecimento gás de arraste vazão do gás de arraste velocidade de aquecimento Especificação entre 25 e 260 ºC nitrogênio 50 mL/min 10 ºC/min Também foram realizadas alterações do método: Ø Teste 1: alterou-se a velocidade de aquecimento para 40 °C/min, com aquecimento até 250 °C e manteve-se os demais parâmetros descritos no Quadro 7. 38 __ 4. Material e Métodos Ø Teste 2: após a análise com os parâmetros normais (Quadro 7), resfriouse a amostra e aqueceu-se novamente nas mesmas condições. As análises foram realizadas no Centro de Desenvolvimento Tecnológico (CDTF), da Faculdade de Farmácia da UFRGS. 4.2.6 Termogravimetria A análise termogravimétrica para a SQR, SIB1, SIB2 e SIB3 foi realizada em equipamento Shimadzu TGA-50H, de 25 a 800 ºC, com massas de amostras de 5 a 10 mg. Empregou-se uma taxa de aquecimento de 10 °C/min e fluxo de 50 mL/min para o gás nitrogênio. As amostras foram inseridas em cápsulas de platina e estas acopladas ao equipamento. Obtiveram-se curvas termogravimétricas (TGA), as quais foram posteriormente derivadas (DTG). Os ensaios foram realizados no Centro Universitário FEEVALE. 4.2.7 Reação para cloretos Pesaram-se cerca de 20 mg da SQR e SIB1, respectivamente. Adicionou-se 1 mL de água. A esta solução, acrescentaram-se: 1 gota de HNO3 1% e 0,5 mL de AgNO3 0,1 M. Formou-se um precipitado branco caseoso, o qual foi filtrado com auxílio de papel filtro. O precipitado retido no filtro foi lavado com três porções de 1 mL de HNO3 1%. Aguardou-se o escoamento do líquido remanescente no precipitado. Dividiu-se o precipitado entre dois tubos de ensaio. Em um tubo de ensaio, realizou-se o teste de solubilidade com HNO3 1%, enquanto no outro com NH4 OH 10%. 39 __ 4.2.8 Reação para aminas terciárias 4. Material e Métodos A reação foi realizada mediante adição de 1 mL de reagente de Feigl-Ohkuma (ácido cítrico 2%, diluído em anidrido acético) à 10 mg de SQR e de SIB1, respectivamente. A seguir, aqueceu-se em banho -maria por cerca de cinco minutos. A positividade do teste é confirmada pelo aparecimento de coloração vermelho escuro à marrom. O conteúdo das cápsulas de sibutramina (CAP) também foi avaliado por esse teste. Para tanto, filtrou-se a solução após a adição do reagente. A seletividade do ensaio foi avaliada mediante análise de outras moléculas de aminas: etilamina, cloridrato de fluoxetina e trietilamina. 4.2.9 Rotação óptica específica A rotação óptica específica foi determinada em polarímetro Perkin Elmer 341, em temperatura ambiente (20 ± 0,5 °C). Utilizou-se uma cubeta de quarzo com 1 dm de percurso óptico. A análise foi realizada com 589,3 nm de comprimento de onda da raia D de sódio. Prepararam-se três soluções etanólicas a 1% p/V para cada análise (SQR e SIB1). A determinação foi realizada em triplicada para cada uma delas. Os cálculos foram efetuados pela substituição dos valores na Equação 1. Equação 1 [α]20D = α/l.c Onde: α = ângulo de rotação; l = comprimento, em dm, da cubeta do polarímetro; c = concentração da substância, expressa em porcentagem p/V. 40 __ 4. Material e Métodos 4.2.9 Cromatografia em camada delgada (CCD) Para o desenvolvimento do método, foram testadas diferentes quantidades de amostra por ponto de aplicação na placa, várias fases móveis, reveladores e substâncias de comparação. O método que apresentou os melhores resultados, associado à simplicidade de realização está detalhado no Quadro 8. Quadro 8. Condições cromatográficas empregadas para análise por CCD de SQR, SIB1. e CAP. CONDIÇÃO Quantidade por ponto de aplicação Fase estacionária Eluente Substância de comparação Reveladores DESCRIÇÃO 30 µg cromatoplacas de gel de sílica GF 254 Merck etanol P.A. cloridrato de diltiazem vapores de iodo ou lâmpada UV 254 nm Preparou-se uma cuba de vidro adicionando-se uma quantidade suficiente do eluente para atingir uma altura de 1 cm. Saturou-se a cuba com o eluente. Para a aplicação da SQR, amostra SIB1, conteúdo de CAP e substância de comparação nas cromatoplacas, foram preparadas soluções etanólicas na concentração de 15 mg/mL do fármaco. Utilizou-se um capilar com volume de 2 µL para a aplicação dos pontos contendo as substâncias em análise. Os pontos de aplicação apresentaram uma distância de 1 cm entre si e de 1,5 cm da borda lateral da cromatoplaca. Além disso, a aplicação foi realizada numa distância de 1 cm da borda inferior da cromatoplaca. Aguardou-se a evaporação do solvente da solução e inseriu-se a cromatoplaca verticalmente numa cuba de vidro previamente preparada para a migração do eluente. Fechou-se a cuba e aguardouse que o eluente migrasse 7 cm. 41 __ 4. Material e Métodos Após a secagem do eluente em temperatura ambiente, procedeu-se a revelação das manchas correspondentes à migração das amostras a partir dos seus respectivos pontos de aplicação. Por fim, determinaram-se os tempos de retenção (Rf), mediante a determinação das distâncias percorridas de cada mancha e do eluente. O Rf da amostra foi comparado com o Rf do cloridrato de diltiazem, em análise simultânea na mesma placa. O Rx foi calculado de acordo com a Equação 2. Equação 2 Rx = RfA / Rf R Onde: RfA = fator de retenção da amostra Rf R = fator de retenção da substância de comparação 4.2.10 Espectrofotometria na região do infravermelho (IV) Os espectros foram registrados em espectrofotômetro de absorção na região do infravermelho (marca Bomen-Hartmann & Braun, série MB), na faixa de 400 a 4000 cm-1. Para tanto, foram produzidas pastilhas de 150 mg de brometo de potássio contendo 1% da SQR e da amostra SIB1, respectivamente, do cloridrato de sibutramina monoidratado. Realizou-se a análise da SQR dessecada e não dessecada. As amostras SIB1, SIB2 e SIB3 foram analisadas na forma não dessecada. Previamente à avaliação das amostras foi realizado um ensaio em branco com uma pastilha contendo 150 mg de brometo de potássio P.A. As análises foram realizadas no Instituto de Física desta Universidade. 42 __ 4.2.11 Espectrofotometria na região do ultravioleta (UV) 4. Material e Métodos Os espectros foram obtidos em espectrofotômetro de absorção na região do ultravioleta (Shimadzu UV-1601PC). Foram traçados espectros com comprimento de onda entre 200 e 400 nm, empregando cubetas de quartzo com 1 cm de percurso óptico. Como diluentes, foram testados: metanol, etanol e solução de ácido clorídrico 0,1 M. Todos os reagentes utilizados nessa análise foram de grau analítico. A concentração da amostra em solução também foi alterada e avaliada. Avaliaram-se os espectros obtidos a partir de soluções com concentrações de 10, 20 e 30 µg/ml. 4.2.12 Aquametria Foram testados e comparados os resultados dos dois métodos descritos a seguir. 4.2.12.1 Método volumétrico por Karl-Fischer O equipamento utilizado foi DL 37 Mettler Toledo, com detecção coulométrica do ponto final. Pesaram-se exatamente cerca de 30 mg da substância em cada análise. Determinou-se o teor de água da SQR e da amostra SIB1, em triplicata, e em três dias diferentes. Paralelamente, procedeu-se um ensaio em branco, com a finalidade de descontar o volume de titulante correspondente à água presente no ar do ambiente de análise. 43 __ 4.2.12.2 Método gravimétrico 4. Material e Métodos Conforme o procedimento geral descrito na F. Bras IV (1988) para a determinação da perda por dessecação, cada ensaio foi efetuado por secagem em estufa até peso constante. Determinou-se a aquametria da SQR e da amostra SIB1, em triplicata, e em três dias diferentes. Além da temperatura usual de 105 ºC, foram testadas temperaturas superiores. Avaliaram-se as perdas de massa mediante dessecação nas temperaturas de 110 e 120 °C. Escolheram-se as condições que forneceram resultados mais reprodutíveis e coerentes com aqueles obtidos pelo método volumétrico. 4.3 ANÁLISE QUANTITATIVA 4.3.1 Volumetria em meio não-aquoso (VMNA) Testaram-se seis métodos diferentes para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado por VMNA. Para a realização de cada método, pesaram-se exatamente cerca de 160 mg da amostra SIB1 de cloridrato de sibutramina monoidratado. A amostra foi solubilizada em ácido acético glacial. Em seguida, adicionaram-se o acetato mercúrico 6% ou o anidridro acético, além de uma solução indicadora. Essa solução foi titulada com ácido perclórico 0,05 M. Efetuou-se um ensaio em branco e este volume foi descontado do volume do titulante gasto no doseamento do fármaco. Os métodos foram codificados de 1 a 6. As diferenças entre os métodos, as quais corresponderam ao aspecto quali e quantitativo de soluções e reagentes empregados, estão descritas no quadro 9. 44 __ 4. Material e Métodos Quadro 9. Descrição quali e quantitativa das soluções e reagentes empregados em cada método testado por VMNA para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado. MÉTODO 1 2 3 4 5 6 Ácido acético glacial (mL) 40 40 40 15 15 15 Acetato mercúrico 6% (mL) 3 3 3 Anidrido acético (mL) 30 30 30 Indicador de ponto final Cristal violeta SI Naftolbenzeína SI Potenciômetro Cristal violeta SI Naftolbenzeína SI Potenciômetro Optou-se pelo uso de indicadores adequados para a técnica por VMNA e com fácil diferenciação das cores. Desses, utilizaram-se o cristal violeta SI (quatro gotas) e naftolbenzeína SI (dez gotas), os quais alteram a cor da solução para verde esmeralda e verde, respectivamente. As soluções indicadoras utilizadas na titulação foram preparadas de acordo com a recomendação da F. Bras. IV (1988). Em cada método com o uso de solução indicadora de ponto final (métodos 1, 2, 4 e 5), procedeu-se, paralelamente, uma titulação potenciométrica (métodos 3 e 6). Para tanto, utilizou-se um potenciômetro da marca Digimed modelo DMPH-2, acoplado a um eletrodo de vidro-calomelano. O ácido perclórico 0,05 M utilizado foi diluído em ácido acético glacial e padronizado frente a uma solução titulante de biftalato de potássio (F. Bras. IV, 1988). Cada solução de amostra ou substância de referência foi titulada, no mínimo cinco vezes, obtendo-se um coeficiente de variação inferior a 1%. Cada mL de titulante 0,05 M equivale a 16,71 mg de cloridrato de sibutramina monoidratado. 45 __ 4. Material e Métodos Os seis métodos foram comparados por análise de variância (ANOVA) e, posteriormente, os resultados de dois deles foram comparados com os obtidos por um método por CLAE previamente validado. 4.3.2 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) Para o desenvolvimento e validação do método por CLAE, utilizou-se um cromatógrafo a líquido Shimadzu LC-10ADvp. Este equipamento foi acoplado a detector de arranjo de fotodiodos SPD-10AVVP (DAD), degaseificador DGU-14A, central de controle SCL-10AVP e injetor manual Rheodyne. Os dados foram obtidos e analisados com o auxílio do aplicativo Class-VP. As fases móveis foram preparadas com solventes de grau analítico adequado para o método de CLAE (J.T. Baker®). A água ultrapura utilizada foi obtida em um sistema MilliQ® Millipore. O método desenvolvido foi validado para matéria-prima e cápsulas industrializadas do cloridrato de sibutramina monoidratado. Para a validação do método para a matéria-prima, foram utilizados a SQR e a amostra SIB 1, enquanto para cápsulas industrializadas foi empregada a amostra CAP. Na fase de desenvolvimento do método, realizaram-se vários testes, com diferentes composições e pH da fase móvel, colunas e fluxos. As condições cromatográficas do método, que apresentaram os melhores resultados para a validação, constam no quadro 10. Cada solução de amostra ou substância de referência foi injetada, no mínimo três vezes, esperando-se obter um coeficiente de variação inferior a 1% (FDA, 1994). Os parâmetros utilizados para a validação foram: especificidade, linearidade, precisão, exatidão e robustez (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). 46 __ 4. Material e Métodos Quadro 10. Condições cromatográficas utilizadas para a validação do método por CLAE para a análise do cloridrato de sibutramina monoidratado. Condição Coluna Pré coluna Fase móvel Volume de injeção Fluxo da fase móvel Detecção Descrição Macherey-Nagel Nucleosil ® C8 ec, 150 x 4,0 mm, partículas 5 µm, poros 100 ? Phenomenex® ACN e água (75:25 V/V), 0,3% trietilamina, pH 7,0 (H3PO4) 20 µL 1,2 mL/min ultravioleta, com λ = 225 nm 4.3.2.1 Especificidade A especificidade do método por CLAE foi determinada mediante a análise da SQR do cloridrato de sibutramina monoidratado na presença de seus produtos de degradação. Para tanto, forçou-se a degradação do fármaco frente a várias condições de estresse, conforme descritas a seguir. 4.3.2.1.7 Temperatura Pesaram-se exatamente cerca de 32 mg da SQR do cloridrato de sibutramina monoidratado, o qual permaneceu em estufa a 80 °C, durante 24 horas. Realizouse a primeira diluição com metanol e a segunda com a fase móvel, a fim de obter uma solução com 60 µg/mL do fármaco. Para a avaliação do comportamento do fármaco na forma farmacêutica cápsulas (CAP), nessa condição de estresse por 10 dias, pesou-se o seu conteúdo e procedeu-se da mesma forma descrita para a matéria-prima, sendo necessária, no entanto, uma etapa de filtração após a primeira diluição. 47 __ 4.3.2.1.8 Luz ultravioleta 4. Material e Métodos Preparou-se uma solução metanólica contendo 600 µg/mL da SQR do cloridrato de sibutramina. Uma alíquota de 1,0 mL dessa solução foi exposta à radiação ultravioleta (254 nm) durante 24 horas, em cubeta de plástico transparente. Após este período, realizou-se uma diluição com a fase móvel, a fim de obter uma solução com 60 µg/mL do fármaco. Procedeu-se simultaneamente um ensaio em branco com a SQR. Esse foi realizado mediante a proteção da cubeta, de forma que a luz não incidisse na solução com o fármaco. 4.3.2.1.9 Hidrólise ácida Pesaram-se exatamente cerca de 32 mg da SQR do cloridrato de sibutramina monoidratado em balão volumétrico de 25 mL. Adicionaram-se 10 mL de HCl 1 M e a mistura foi agitada mecanicamente durante duas horas. Em seguida, neutralizouse a solução com NH4OH 1 M e diluiu-se com a fase móvel até a obtenção de uma solução contendo 60 µg/mL do fármaco. O mesmo procedimento foi realizado para o fármaco na forma farmacêutica cápsulas, realizando-se uma filtração após a primeira diluição. 4.3.2.1.10 Hidrólise alcalina Pesaram-se exatamente cerca de 32 mg da SQR do cloridrato de sibutramina monoidratado em balão volumétrico de 25 mL. Adicionaram-se 10 mL de NaOH 1 M e a mistura foi agitada mecanicamente durante duas horas. Em seguida, neutralizouse a solução com H3PO4 10% e diluiu-se com a fase móvel até a obtenção de uma solução contendo 60 µg/mL do fármaco. O mesmo procedimento foi realizado para o fármaco na forma farmacêutica cápsulas, realizando-se uma filtração após a primeira diluição. 48 __ 4.3.2.1.11 Oxidação 4. Material e Métodos Pesaram-se exatamente cerca de 32 mg da SQR do cloridrato de sibutramina monoidratado em balão volumétrico de 25 mL. Adicionaram-se 10 mL de peróxido de hidrogênio 3% e a mistura foi agitada durante duas horas. Diluiu-se com a fase móvel até a obtenção de uma solução com 60 µg/mL do fármaco. O mesmo procedimento foi realizado para o fármaco na forma farmacêutica cápsulas, realizando-se uma filtração após a primeira diluição. 4.3.2.1.6 Solução simulada de excipientes Para avaliar a especificidade do método para o doseamento do fármaco na presença de excipientes presentes na formulação, preparou-se uma solução simulada contendo os últimos. Realizaram-se as diluições de acordo com o procedimento para cápsulas, ou seja, a primeira diluição em metanol e a segunda em fase móvel. A solução final desse placebo foi constituída de: dióxido de silício, estearato de magnésio, lactose e celulose microcristalina, nas concentrações 10, 20, 490 e 520 µg/mL, respectivamente. 4.3.2.2 Linearidade Para a constatação da linearidade do método proposto, por CLAE, construíram-se três curvas padrão, sendo cada uma em um dia diferente. Cada curva foi realizada com sete concentrações diferentes. Para cada curva, preparou-se uma solução metanólica da SQR, numa concentração de 250 µg/mL referente ao cloridrato de sibutramina anidro. Alíquotas dessa solução-estoque foram transferidas para balões volumétricos, com o auxílio de uma bureta. As soluções finais foram diluídas na fase móvel empregada no método desenvolvido por CLAE. O esquema de diluições utilizado para o preparo de cada solução, bem como as respectivas concentrações obtidas, estão demonstrados na Tabela 1. 49 __ 4. Material e Métodos Realizaram-se três injeções para cada solução da curva padrão. Calculou-se a média das áreas obtidas para os pontos de cada curva. Os valores das áreas médias absolutas foram plotados versus as respectivas concentrações (µg/mL) para a obtenção do gráfico da curva padrão. A regressão linear pelo método dos mínimos quadrados foi utilizada para as determinações da equação da reta e do coeficiente de correlação (r). Por fim, a linearidade do método foi estabelecida mediante a análise de variância (ANOVA) dos resultados. Tabela 1. Esquema d diluições utilizado nas curvas-padrão, a partir de uma solução e estoque contendo 250 µg/mL da SQR. PONTO Nº 1 2 3 4 5 6 7 Alíquota da solução estoque de SQR (mL) 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 Balão volumétrico (mL) 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 25,0 Concentração final (µg/mL) 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 4.3.2.3 Limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) O limite de detecção (LD) foi estimado através da Equação 3, enquanto o limite de quantificação (LQ) foi calculado através da Equação 4. Essas equações consideram os dados obtidos para as curvas-padrão (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). 50 __ Equação 3 LD = (3,3 x s) / b 4. Material e Métodos Equação 4 LQ = (10 x s) / b Onde: s = desvio padrão médio do intercepto de três curvas padrão; b = coeficiente de correlação linear. 4.3.2.4 Precisão A precisão do método por CLAE foi estabelecida através de análises de soluções do cloridrato de sibutramina em três diferentes dias, comparando-se a amostra SIB1 com a SQR. Para tanto, pesaram-se exatamente cerca de 32 mg da de cloridrato de sibutramina monoidratado e esse foi dissolvido e diluído com metanol em balão volumétrico de 25 mL. Transferiu-se uma alíquota de 1,0 mL desta solução para um balão volumétrico de 20 mL. Completou-se o volume com a fase móvel descrita no Quadro 10 (p. 47), obtendo-se uma solução para análise com 60,0 µg/mL. Em cada dia foram preparadas e analisadas seis diferentes soluções contendo 60,0 µg/mL de cloridrato de sibutramina anidro, as quais foram pesadas individualmente. No total dos três dias foram analisadas 18 soluções. Realizaram-se três injeções para cada solução. A precisão do método para a determinação do fármaco em CAP foi determinada da mesma maneira descrita para matéria-prima. No entanto, adaptouse a massa a ser pesada de acordo com o peso médio das cápsulas e seu respectivo conteúdo de fármaco. Além disso, filtrou-se a solução metanólica antes da transferência da alíquota de 1,0 mL para o balão volumétrico de 20 mL. 51 __ 4. Material e Métodos A repetibilidade foi avaliada pelo cálculo dos DPR das médias das seis determinações diárias. Enquanto a precisão intermediária foi verificada através do desvio padrão relativo (DPR) das médias obtidas nos três dias (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). As concentrações das soluções de amostra foram calculadas através da Equação 5 (F. Bras. IV, 1988), seguidas da Equação 6. Equação 5 CA = A A . C SR / ASR Equação 6 CA (%) = C A . 100 / C T Onde: CA = concentração real do fármaco na solução de amostra (mg/mL); AA = área absoluta da amostra (média de três injeções); CSR = concentração do fármaco na solução da substância de referência (mg/mL); ASR = área absoluta da substância de referência (média de três injeções); CA (%) = concentração do fármaco na amostra; CT = concentração teórica do fármaco na solução de amostra (mg/mL). 4.3.2.5 Exatidão A exatidão do método para a determinação de matéria-prima foi inferida a partir dos resultados obtidos nas avaliações da especificidade, linearidade e precisão. 52 __ 4. Material e Métodos Para o produto acabado, avaliou-se a exatidão do método através de testes de recuperação do fármaco. Para tanto, adicionaram-se quantidades conhecidas da SQR sobre a amostra de cápsulas. Prepararam-se as seguintes soluções metanólicas: Ø Solução da amostra (S A): realizou-se o peso médio do conteúdo da amostra CAP. A seguir, pesou-se uma quantidade do seu conteúdo para preparar uma solução contendo exatamente cerca de 250 µg/mL de cloridrato de sibutramina anidro. Diluiu-se em metanol e filtrou-se com auxílio de papel filtro. Ø Solução da SQR (S P): preparou-se uma solução contendo exatamente cerca de 250 µg/mL de cloridrato de sibutramina anidro. Diluiu-se em metanol e filtrou-se com auxílio de papel filtro. Alíquotas das soluções SA e SP foram utilizadas para preparar as soluções para avaliação da recuperação da SQR na amostra de CAP. Obtiveram-se soluções com concentrações finais de 50, 60 e 70 µg/mL. O esquema utilizado para o preparo destas soluções, com mistura de alíquotas de SA e SP, está demonstrado na Tabela 2. Tabela 2. Esquema para o preparo das soluções para avaliação da recuperação do cloridrato de sibutramina na sua determinação em cápsulas. Solução Alíquota de SA Alíquota de Sp (mL) (mL) 4 4 4 4 0 0 1 2 3 4 Balão volumétrico (mL) 25 25 25 25 25 Concentração final teórica (%) 40 50 60 70 40 A A1 A2 A3 P 53 __ 4. Material e Métodos 4.3.2.6 Robustez Algumas variações das condições cromatográficas estipuladas (Quadro 10, p. 47) foram realizadas para avaliar o parâmetro de robustez do método desenvolvido por CLAE. As alterações são apresentadas no Quadro 11. As demais condições foram mantidas. Prepararam-se soluções estoque contendo 600 µg/mL de SQR e de SIB1, respectivamente, as quais foram diluídas em metanol. As soluções finais, na concentração de 60 µg/mL, foram diluídas na fase móvel referente à cada condição de avaliação. Além das alterações descritas, analisou-se a solução de SQR em outro cromatógrafo a líquido de alta eficiência. Utilizou-se o equipamento Shimadzu LC10AD, acoplado a detector de ultravioleta SPD-10A, degaseificador DGU-14A, central de controle SCL-10AVP e injetor manual Rheodyne. Os dados foram obtidos e analisados com o auxílio do aplicativo Class-VP. Quadro 11. Modificações das condições cromatográficas para a avaliação da robustez do método por CLAE. Fase móvel Coluna* ACN:água (% V/V) Macherey-Nagel Nucleosil ® ec Macherey-Nagel Nucleosil ® ec Macherey-Nagel Nucleosil ® ec Macherey-Nagel Nucleosil ® ec Macherey-Nagel Nucleosil ® ec Shimadzu 75:25 75:25 75:25 73:27 77:23 75:25 pH da água 7,0 6,8 7,2 7,0 7,0 7,0 * Coluna C8 150 x 4,0 mm, partículas 5 µm, poros 100 ? . 54 __ 4. Material e Métodos 4.3.3 Comparação estatística entre os métodos de doseamento Os resultados obtidos em dois métodos por VMNA foram comparados estatisticamente através da análise de variância (ANOVA) com o método por CLAE validado. 4.4 ESTUDO PRELIMINAR DA ESTABILIDADE Realizaram-se estudos preliminares e acelerados de estabilidade do fármaco, frente à temperatura, e à radiação UVB e UVC. Cada fator foi avaliado com a SQR cloridrato de sibutramina monoidratado, antes e após vários tempos de degradação, os quais foram estabelecidos experimentalmente. As avaliações dos teores e produtos de degradação foram acompanhadas por CLAE. 4.4.1 Exposição à temperatura elevada Pesou-se uma quantidade de SQR para obter uma solução final com 60 µg/mL. A SQR do fármaco foi submetida à temperatura de 60 ºC, em estufa, pelo período de um, dois, três e dez dias. Após cada tempo de exposição, o fármaco foi diluído em metanol e posteriormente em fase móvel. Realizaram-se três injeções para cada tempo de exposição. 4.4.2 Exposição à radiação ultravioleta Submeteu-se 1,0 mL de solução metanólica contendo 600 µg/mL da SQR à radiação UV 254 nm (lâmpada Philips TUV lamp; 30 W; 96 V; 0,36 A) e UV 352 nm (Blacklight blue lamp, marca Orion; 30 W; 130V), respectivamente, em câmara espelhada internamente. Após o período de um, dois, três e quatro dias de exposição à radição UVA ou UVB, diluiu-se a alíquota em fase móvel para obter uma 55 __ 4. Material e Métodos solução com a concentração de 60 µg/mL. Realizaram-se três injeções para cada tempo de exposição. O estudo foi realizado em solução porque essa condição permite melhor penetrabilidade da luz em comparação à substância no estado sólido (CONNORS, 1986). Paralelamente, submeteu-se uma amostra às mesmas condições, porém com proteção à incidência de radiação (substância não degradada). 56 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ___________________________________________________________________ __ __________ 6. Conclusões 5.1 SUBSTÂNCIA QUÍMICA DE REFERÊNCIA E AMOSTRAS Em casos de inexistência de sustâncias de referência oficializadas por códigos autorizados pela legislação vigente, admite-se o uso de padrões de trabalho. Tais padrões devem ter a sua identidade e o seu teor adequadamente comprovados (BRASIL, 2003 b). Neste trabalho, utilizou-se um padrão de trabalho, denominado SQR, que foi caracterizado e quantificado, a fim de garantir a sua identidade e um grau de pureza aceitável. Para tanto, foi necessário escolher um dos lotes das amostras adquiridas de matérias-primas do fármaco. O critério de escolha para a SQR foi embasado nos resultados obtidos por DSC. A escolha da SIB1 para ser analisada por todos os métodos qualitativos e quantitativos também foi embasada nesse teste (item 5.2.5, p. 66). A SQR, a SIB1 e as demais amostras (SIB2 e SIB3) foram utilizadas para a avaliação do comportamento termoanalítico do fármaco, pelas técnicas de: DSC e TGA. Todas as análises foram realizadas com a SQR ou a amostra na sua forma não dessecada. Optou-se por isso, pois houve indícios de degradação térmica do fármaco mediante dessecação em estufa (item 5.2.13.2, p. 83), o que poderia interferir nas análises. Os ensaios de doseamento foram sempre acompanhados da determinação do teor de água pelo método volumétrico (Karl Fischer), o qual foi considerado nos respectivos cálculos. O doseamento do fármaco no produto acabado (CAP) foi validado por CLAE. O valor rotulado de cada cápsula é de 15 mg de cloridrato de sibutramina monoidratado, equivalendo a 12,55 mg de sibutramina base anidra. O peso médio do conteúdo de 20 cápsulas foi de 0,2431 g, determinado de acordo com F. Bras. IV (1988). 59 __ 5.2 ANÁLISE QUALITATIVA __________ 6. Conclusões Os testes qualitativos são realizados para garantir a identidade de determinada substância em uma amostra. Isso, geralmente, é demonstrado mediante a comparação das propriedades da amostra com uma substância de referência (ICH, 2005). A análise qualitativa do cloridrato de sibutramina monoidratado incluiu métodos capazes de assegurar a identificação, sendo muitos deles também passíveis de realização em farmácias magistrais. 5.2.1 Descrição A avaliação dos caracteres organolépticos, por um analista experiente, pode contribuir para o controle de qualidade de uma matéria-prima farmacêutica. Tais características podem evidenciar a ocorrência de degradações do fármaco. A SQR e amostra SIB1 do cloridrato de sibutramina monoidratado apresentaram-se como um pó branco à quase branco, cristalino e com odor característico. Os resultados obtidos estavam conforme a especificação descrita no certificado de análise emitido pelo fornecedor do fármaco. Mediante uma avaliação macroscópica foi possível verificar que os tamanhos das partículas da SQR, SIB1 e SIB2 do fármaco eram semelhantes entre si. No entanto, as partículas da amostra SIB3 eram visivelmente maiores. É importante que o fabricante padronize o tamanho das partículas da matériaprima utilizada na formulação farmacêutica, realizando um controle por meio de análise granulométrica. Afinal, tal medida é uma das características que exerce influência na taxa de dissolução do fármaco nos fluidos gastrintestinais. Esse fator pode contribuir na absorção, principalmente em casos de fármacos pouco solúveis (ANSEL et al, 2000; GOODMAN et al, 2006; RANG et al, 2007). 60 __ 5.2.2 Solubilidade __________ 6. Conclusões Apesar da técnica para a determinação da solubilidade ser simples, uma avaliação precisa é relativamente difícil (KAWAKAMI et al, 2005) e não deve ser considerada como uma constante física (F. Bras. IV, 1988). Ainda assim, os resultados da solubilidade podem ser úteis para predizer a qualidade de uma matéria-prima farmacêutica. Quando a solubilidade obtida apresenta elevada discrepância quanto à especificação, a justificativa pode ser uma ou mais das seguintes: ocorrência de polimorfismo, presença de impurezas ou a identidade do fármaco não é confirmada (GU e GRANT, 2001). A avaliação da solubilidade para a SQR e a amostra SIB1, em diversos solventes, está demonstrada no Quadro 12. A classificação de solubilidade obtida foi idêntica para SQR e SIB1, frente aos solventes testados. A amostra SIB2 diferiu de SQR e SIB1 quanto à solubilidade apenas em acetato de etila (muito pouco solúvel) e em ácido clorídrico 0,1 M (pouco solúvel). A amostra SIB3 apresentou a mesma solubilidade que SQR e SIB1 nos solventes metanol, etanol e acetato de etila, enquanto nos demais solventes mostrou um nível de solubilidade superior. De acordo com BUDAVARI (2001), o cloridrato de sibutramina monoidratado apresenta uma solubilidade de 2,9 mg/mL em água, em pH 5,2. O resultado encontrado foi condizente com essa especificação, ou seja, pouco solúvel. O certificado de análise dos fabricantes do cloridrato de sibutramina monoidratado informou que este é facilmente solúvel em metanol e N,Ndimetilformamida. Contudo, para o metanol, houve alteração do termo descritivo de solubilidade em um nível, apresentando maior solubilidade que a indicada, o que é perfeitamente aceitável. 61 __ __________ 6. Conclusões Quadro 12. Avaliação da solubilidade para SQR e SIB1, conforme a classificação descrita na F. Bras. IV (1988). Solvente Água Metanol Etanol N,N-Dimetilformamida Acetato de etila Éter etílico HCl 0,1 M NaOH 0,1 M Termo Descritivo para SQR e SIB1 Pouco solúvel Muito solúvel Facilmente solúvel Facilmente solúvel Praticamente insolúvel ou insolúvel Praticamente insolúvel ou insolúvel Muito pouco solúvel Praticamente insolúvel ou insolúvel Classificação de Solubilidade* De 100 a 1.000 partes Menos de 1 parte De 1 a 10 partes De 1 a 10 partes Mais de 10.000 partes Mais de 10.000 partes De 1.000 a 10.000 partes Mais de 10.000 partes * Conforme a F. Bras. IV (1988), o termo partes refere-se à dissolução de 1 g do fármaco por mililitros do solvente estabelecido no número de partes. O cloridrato de sibutramina monoidratado apresentou maior solubilidade em solventes polares (metanol, etanol e N,N-dimetilformamida) do que em solventes pouco polares (éter etílico e acetato de etila). No entanto, o fármaco não apresentou solubilidade em água. Logo, verificou-se que a molécula do fármaco é moderadamente polar. Certamente, a formação do sal de cloridrato na molécula do fármaco colaborou para o aumento de sua solubilidade. A maior solubilidade do cloridrato de sibutramina monoidratado em uma solução ácida diluída (HCl 0,1 M) do que em soluções alcalinas é uma característica dos sais de aminas não solúveis em água. O mecanismo que justifica tal característica está apresentado no Esquema 1 (SOLOMONS e FRYHLE, 2005). 62 __ __________ 6. Conclusões (R1)(R2)(R3)N : amina insolúvel em água + H+ – Cl- (R1)(R2)(R3)N+ – H + sal de amínio solúvel em água Cl- Esquema 1 5.2.3. Determinação do pH em solução A medida potenciométrica de pH ocorre mediante alteração do potencial de uma célula galvânica, a qual é inserida na solução cujo pH se quer determinar. A determinação do pH em solução aquosa constitui um método rápido e simples, auxiliando na caracterização do fármaco (KOROLKOVAS, 1988). A média dos resultados obtidos na determinação do pH das soluções de SQR e SIB1 é apresentada na Tabela 3. Tabela 3. Média da determinação do pH de soluções aquosas a 2% da SQR e amostra SIB1. SQR Média (%) DPR (%) 4,92 0,48 SIB1 4,70 0,53 Os valores de pH obtidos estão dentro da faixa de pH especificada no certificado de análise emitido pelos fornecedores do fármaco, ou seja, de 4,5 a 5,5 para uma solução aquosa a 2%. 63 __ 5.2.4. Determinação da faixa de fusão __________ 6. Conclusões A determinação desse parâmetro infere a pureza de uma substância química, quando comparado com uma substância padrão ou dados de literatura (SHRINER et al, 2004). Entretanto, para a confirmação da identidade do fármaco é necessária a realização de ensaios complementares a esse. No equipamento Mettler Toledo, modelo FP90, a faixa de fusão foi determinada mediante a passagem de luz através do tubo capilar no momento em que iniciou e em que terminou a fusão do sólido. Já no equipamento de bloco metálico aquecido, segundo Koffler, a verificação da faixa de fusão foi acompanhada visualmente através do microscópio. Os resultados obtidos nos equipamentos, para três determinações de faixas de fusão para SQR e SIB1, foram corrigidos em relação a uma substância padrão e estão dispostos na Tabela 4. Concomitantemente, é realizada a comparação com os resultados presentes nos certificados de análise dos fornecedores e as faixas de fusão obtidas por DSC (item 5.2.5). Não foi calculado o DPR dos resultados, pois os valores obtidos representam uma faixa e não um ponto de fusão. Tabela 4. Comparação dos valores das faixas de fusão obtidas para SQR e SIB1, pelo fornecedor e pelos equipamentos segundo Koffler, Mettler Toledo e DSC. Resultado do fornecedor* Equipamento DSC Equipamento bloco metálico aquecido** 199 - 203 ºC Equipamento Mettler Toledo FP90** 196,5 - 198,1 ºC 197,1 - 198,3 ºC 196,8 - 198,8 ºC 196,3 - 197,9 ºC 195,7 - 198,4 ºC 195,9 - 198,1 ºC SQR 195,2 - 196,6 ºC 197,89 - 199,74 º C 198 - 202 ºC 199 - 203 ºC 198 - 202 ºC SIB1 192,5 - 195,8 ºC 198,37 - 200,20 ºC 199 - 203 ºC 198 - 201 ºC * Resultado indicado no certificado de análise emitido pelo fornecedor da matéria-prima. ** Valores corrigidos em relação a uma substância padrão de ponto de fusão. 64 __ __________ 6. Conclusões Os resultados obtidos pelo equipamento Mettler Toledo e bloco metálico aquecido apresentaram uma pequena diferença de 1 a 4 ºC. Ainda assim, em ambos os casos, as faixas de fusão variaram ±2 ºC em relação valor obtido por DSC, considerado o mais correto. As faixas de fusão apresentaram diferença em relação à indicação na literatura, correspondente a uma faixa de 193 a 195,5 ºC (BUDAVARI, 2001). Na avaliação, é importante considerar que a SQR e a amostra SIB1 foram sintetizadas na Índia e na China, respectivamente. Enquanto a especificação da faixa de fusão indicada por BUDAVARI (2001), provavelmente, corresponde à molécula sintetizada pela indústria Abbott, detentora da patente do cloridrato de sibutramina monoidratado até o ano de 2006. Assim, alguns fatores podem ser responsáveis pela diferença em relação àquela especificação. As discrepâncias podem ser devido a diferentes formas polimórficas da molécula, produzidas na etapa de cristalização ou até mesmo durante o transporte e armazenamento. A forma polimórfica mais estável, ou seja, com menor energia livre, possui um ponto (ou faixa) de fusão maior (AULTON et al, 2005). Portanto, é possível que a estrutura cristalina das moléculas correspondentes à SQR e à SIB1 seja a mais estável. Para confirmar essa hipótese seria necessário dispor de uma amostra de matéria-prima sintetizada pela Abbott e realizar os ensaios pertinentes para a avaliação de polimorfismo. A presença de impurezas em grande quantidade também poderia justificar as diferenças entre as faixas de fusão obtidas. Entretanto, esta possibilidade foi desconsiderada, pois as análises por outras técnicas quali e quantitativas comprovaram a identidade química e a pureza da SQR e da SIB1. Apesar disso, os resultados apresentados nos certificados de análise emitidos pelos fabricantes de SQR e SIB1 foram diferentes dos obtidos neste trabalho. A diferença pode estar relacionada com o tipo de equipamento, velocidade de aquecimento e na utilização ou não de substância padrão para a correção da faixa de temperatura observada. 65 __ __________ 6. Conclusões Após a fusão do fármaco, observou-se a formação de um produto de coloração amarelada. Através da observação no equipamento de bloco metálico aquecido, verificou-se que a ebulição ocorreu logo após a fusão das amostras. A faixa de ebulição ocorreu entre 210 e 212 ºC. 5.2.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) A calorimetria exploratória diferencial (DSC) é uma técnica em que as diferenças no fluxo de calor na amostra e na referência são medidas como função da temperatura da amostra enquanto as duas são submetidas a um programa de temperatura controlada. Dessa forma, é determinada a entalpia envolvida em transições endotérmicas ou exotérmicas (SKOOG et al, 2002). Esse método térmico fornece informações úteis para avaliação do comportamento de fármacos, tais como: formação do cristal, polimorfismo, temperatura de fusão, sublimação, desidratação, evaporação e pureza (ARMIJO et al, 2004; SUITCHMEZIAN et al, 2007; USP 30, 2007). Os parâmetros experimentais influem nos resultados das análises por DSC. Então, devem ser citadas as informações referentes à massa de amostra, material do porta-amostra, vazão e natureza do gás de arraste e velocidade de aquecimento (ARMIJ O et al, 2004; BERNAL et al, 2002). Observaram-se dois perfis distintos entre os termogramas obtidos para a SQR e para as amostras SIB1, SIB2 e SIB3, respectivamente. Verificou-se que a SQR e SIB1 (Figura 3) apresentaram um comportamento térmico semelhante, enquanto SIB2 e SIB3 (Figura 4) apresentaram outro perfil. Os termogramas referentes à SQR e à SIB1 apresentaram três eventos endotérmicos principais. O primeiro evento, com a forma larga, corresponde à perda de água de hidratação, o segundo à fusão e o terceiro à volatilização. No final do último evento há, aparentemente, a sobreposição de outro evento, ocasionando o alargamento do pico. Para verificar se isso é devido à degradação térmica da amostra, realizou-se outro teste por DSC, com alteração dos parâmetros do Quadro 66 __ __________ 6. Conclusões 7 (p. 38). Aumentando a velocidade de aquecimento para 40 °C/min e mantendo-se os demais parâmetros do método original, obteve -se um termograma com todos os eventos deslocados para uma temperatura maior, além do alargamento da forma dos picos (Figura 3). Não foram verificados, porém, sinais de degradação com essas alterações. Então, a sobreposição de picos no final do termograma pode ser devido à diferença de temperatura entre a tampa e o fundo do porta-amostra, sendo a segunda maior que a primeira. Por isso, numa temperatura ligeiramente superior ao ponto de ebulição, pode haver condensação do material volatilizado na tampa do porta-amostra, o qual sofre ebulição novamente em temperatura mais elevada. DSC mW 100 Temperatura (ºC) 200 Figura 3. Termogramas obtidos para: SQR (preto) e SIB1 (vermelho), de acordo com as condições analíticas descritas para a técnica de DSC no Quadro 7 (p. 38); SIB1 (azul) com velocidade de aquecimento 40 ºC/min e demais condições mantidas. 67 __ __________ 6. Conclusões O primeiro e o segundo eventos ocorreram em temperaturas similares nas quatro amostras. Entretanto, os termogramas para SIB2 e SIB3 apresentaram eventos endotérmicos adicionais em relação à SQR e à SIB1. O segundo e o terceiro eventos de SIB2 e SIB3 podem ser devido à fusão de uma forma polimórfica I, seguida de cristalização e fusão de uma forma polimórfica II, respectivamente. Esses casos podem ser justificados quando há polimorfismo da molécula ou pseudopolimorfismo devido à água de hidratação. No último caso, partículas de tamanhos maiores influem negativamente na remoção da água da rede cristalina, o que pode contribuir para a existência de dois eventos de fusão, sendo um na forma anidra e outro na forma hidratada. Posteriormente a esses processos, ocorreu outro evento, que, provavelmente, corresponde à ebulição. O final desse evento, como justificado para SQR e SIB1, pode ser devido à condensação e posterior ebulição. DSC mW 100 Temperatura (ºC) 200 Figura 4. Termogramas obtidos para: SIB2 (preto) e SIB3 (vermelho), de acordo com as condições analíticas descritas para a técnica de DSC no Quadro 7 (p. 38). 68 __ __________ 6. Conclusões Para averiguar a existência de polimorfos, realizou-se uma análise com os parâmetros originais (Quadro 7, p. 38), sendo a amostra resfriada e aquecida novamente nas mesmas condições e não se obteve termograma. A razão para tal fato é que a amostra foi aquecida até 250 ºC, temperatura muito superior ao seu ponto de ebulição, sendo assim eliminada através dos orifícios do porta-amostra, logo após o primeiro aquecimento. Os dados obtidos pela técnica de DSC para a SQR e amostras são apresentados na Tabela 5. Tabela 5. Dados obtidos pela técnica de DSC para SQR e amostras SIB1, SIB2 e SIB3. Amostra 1º EVENTO Heat+ (-J/g) 2º EVENTO Onset (°C) Peak (°C) 3º EVENTO Peak (°C) 4º EVENTO Peak (°C) Heat+ (J/g) (massa, Onset Peak (°C) gramas) (°C) SQR* (1,30) SIB1* (1,81) SIB1** (1,84) SIB2* (1,51) SIB3* (1,13) 95,7 115,66 Heat+ Onset (-J/g) (°C) Heat+ Onset (-J/g) (°C) 88,40 197,89 199,74 75,59 203,52 207,40 156,58 - - - 95,99 118,42 95,67 198,37 200,20 82,91 205,53 210,31 177,11 - - - 110,59 136,56 86,98 201,02 205,81 89,83 219,21 230,37 165,73 - - - 101,76 118,79 72,40 196,54 198,99 43,69 202,93 206,74 33,91 211,41 214,12 - 96,14 113,29 68,68 196,55 199,48 41,00 202,98 206,95 37,08 208,65 212,94 - * Técnica conforme parâmetros descritos no Quadro 7 (p. 38). ** Técnica com velocidade de aquecimento de 40 °C/min e demais parâmetros conforme descritos no Quadro 7 (p. 38). + Calculado em relação à área entre vale e pico. Testes adicionais, como microscopia e difração de raios-X, variações das condições de DSC e TGA acoplada a equipamento para a identificação de gases, como espectrofotômetro na região do infravermelho ou espectrômetro de massas, podem ser úteis para confirmar a hipótese de polimorfismo para este fármaco. 69 __ __________ 6. Conclusões Também podem ser realizados estudos de cinética de degradação térmica e, se for confirmada, proceder a caracterização física e química dos produtos obtidos. 5.2.6 Termogravimetria (TGA) A análise termogravimétrica (TGA) consiste em medir a variação de massa de uma amostra em função da temperatura, sob uma atmosfera controlada. A informação obtida por esse método é mais limitada, porém mais específica, que a obtida por DSC porque uma variação de temperatura deve provocar uma alteração na massa da substância (SKOOG et al, 2005). As principais aplicações dessa técnica na área farmacêutica, quando em atmosfera inerte, são para a avaliação da estabilidade térmica de fármacos, do processo de volatilização e do teor de água na molécula (ARMIJO et al, 2004; USP 30, 2007). As curvas termogravimétricas obtidas para a SQR, a SIB1, a SIB2 e a SIB3 apresentaram duas perdas de massa e são apresentadas nas Figuras 5, 6, 7 e 8, respectivamente. Entretanto, as temperaturas de cada evento variaram entre algumas amostras e uma comparação desses valores é apresentada na Tabela 6. TGA 100 % DTG mg/min 2 50 0 -2 0 0 200 400 600 800 Temperatura (ºC) Figura 5. Curva termogravimétrica da SQR obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39). TGA (preto) e DTG (vermelho). 70 __ __________ 6. Conclusões TGA 100 % DTG mg/min 0 50 -2 -4 0 0 200 400 600 800 Temperatura (ºC) Figura 6. Curva termogravimétrica da SIB1 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39). TGA (preto) e DTG (vermelho). TGA 100 % DTG mg/min 50 0 0 0 200 400 600 800 -5 Temperatura (ºC) Figura 7. Curva termogravimétrica da SIB2 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39). TGA (preto) e DTG (vermelho). O primeiro evento existente nas curvas obtidas para SQR e amostras SIB1, SIB2 e SIB3, corresponde, provavelmente, à perda da água de hidratação da molécula do fármaco, a qual possui uma especificação de teor entre 5 e 6%. Comparações desses valores com os obtidos pelos métodos de Karl-Fischer e perda 71 __ __________ 6. Conclusões por dessecação para a determinação do teor de água são apresentadas nos itens 5.2.13.1 e 5.2.13.2 (p. 81 e 83, respectivamente). TGA 100 % 50 0 0 0 200 400 600 800 -5 Temperatura (ºC) Figura 8. Curva termogravimétrica da SIB3 obtida nas condições descritas no item 4.2.6 (p. 39). TGA (preto) e DTG (vermelho). Tabela 6. Dados obtidos pela técnica de TGA para SQR e amostras SIB1, SIB2 e SIB3. Amostra (massa, gramas) SQR (4,13) SIB1 (4,54) SIB2 (8,50) SIB3 (10,68) Onset (°C) 90,19 77,99 96,28 121,35 1º EVENTO Endset (°C) 90,50 114,75 124,92 149,26 Perda (%) 6,01 5,86 5,87 5,46 Onset (°C) 206,56 206,51 219,07 222,70 2º EVENTO Endset (°C) 234,04 238,31 254,27 258,00 Perda (%) 93,99 93,19 93,64 94,55 72 __ __________ 6. Conclusões Para a SQR e todas as amostras, foi constatada uma perda de massa quase total no segundo evento observado na curva obtida por TGA. Essa alteração é correspondente à volatilização, o que também foi verificado na análise por DSC. As duas perdas totalizam quase 100% para todas as amostras, o que indica que não há decomposição térmica do fármaco. 5.2.7 Reação para cloretos Fármacos na forma de cloridrato reagem com AgNO3 0,1 M, em meio acidificado com HNO3 1%, formando um precipitado branco caseoso. O precipitado é insolúvel em ácido nítrico e solúvel em hidróxido de amônio 6 M (F. Bras. IV, 1988; KOROLKOVAS, 1988; USP 30, 2007). Para a maioria das moléculas o ensaio é bastante simples, constando apenas da adição das soluções mencionadas. No entanto, o cloridrato de sibutramina, um sal de amina, não respondeu ao teste usual. Nesse caso é recomendada uma etapa adicional de centrifugação após a formação do precipitado (USP 30, 2007). Realizou-se uma adaptação dessa técnica para determinação de cloretos (USP 30, 2007), mediante alteração da centrifugação por uma filtração e coleta do precipitado. Optou-se por essa troca para evitar a necessidade de uma centrífuga, equipamento geralmente indisponível em farmácias. O ensaio foi realizado com a SQR e com a amostra SIB1 do cloridrato de sibutramina monoidratado. Em ambos os casos, o analito reagiu com o AgNO3 e produziu um precipitado branco. O precipitado formado foi insolúvel em HNO3 1% e solúvel em NH4OH 6 M, confirmando a presença de cloretos nas amostras. 5.2.8 Reação para aminas terciárias A análise química para aminas terciárias é mais complexa que para aminas primárias e secundárias, devido à ausência de hidrogênios substituíveis ligados ao 73 __ __________ 6. Conclusões átomo de nitrogênio nas primeiras. Aminas terciárias reagem, sob aquecimento, com ácidos policarboxílicos e anidrido acético formando compostos cromogênicos (CONNORS e IFAN, 1987; FEIGL, 1960). O teste descrito por Feigl-Ohkuma, com adição de uma solução contendo ácido cítrico 2% em anidrido acético, caracteriza as aminas terciárias alifáticas. A positividade é confirmada através do desenvolvimento de cor vermelha que passa a castanho (CHERONIS et al, 1965; EGER et al, 1999). A seletividade do ensaio para a identificação de aminas terciárias foi avaliada mediante testes com uma amina primária (etilamina), uma amina secundária (cloridrato de fluoxetina) e uma amina terciária (trietilamina). As respectivas moléculas são apresentadas na Figura 9. O CH3 CH2 NH 2 F3C (B) H N CH 3 .HCl CH3 CH3 CH2 CH2 NH (A) (C) Figura 9. Estruturas químicas correspondentes a: etilamina (A), cloridrato de fluoxetina (B) e trietilamina (C). As reações realizadas para a amina primária e para a amina secundária não formaram a coloração vermelha. A SQR, a SIB1, o conteúdo das cápsulas (CAP) e a trietilamina apresentaram resultado positivo para a reação de Feigl-Ohkuma, que pode ser considerada adequada e seletiva para a identificação da amina terciária presente na molécula do cloridrato de sibutramina (matéria-prima e cápsulas), podendo ser aplicada em farmácias magistrais. 74 __ 5.2.9 Rotação óptica específica __________ 6. Conclusões A determinação da rotação óptica permite estabelecer a identidade, a pureza e, às vezes, indica o valor terapêutico da substância. As substâncias que desviam o plano da luz polarizada são ditas opticamente ativas, podendo ser classificadas em dextrógiras (+) ou levógiras (-) (F. Bras. IV, 1988). Geralmente, um dos enantiômeros de um fármaco quiral é mais ativo do que o outro. Contudo, apenas em casos em que um dos enantiômeros é tóxico ou possui efeitos colaterais importantes o enantiômero isolado é usado. A principal razão para isto é o elevado custo para o isolamento de um enantiômero de uma mistura racêmica (MOORE et al, 1999; WATSON, 2005). A molécula do cloridrato de sibutramina apresenta um centro quiral (Figura 1) e é comercializada na forma de mistura racêmica, ou seja, na proporção 1:1 de cada enantiômero (ABBOTT, 2006 b; MEDLEY, 2006). Conseqüentemente, conforme o esperado, a rotação óptica específica foi próxima a zero. As médias dos resultados obtidos na determinação da rotação óptica da amostra analisada e SQR são apresentadas na Tabela 7. Tabela 7. Média de três determinações do poder rotatório específico para soluções etanólicas a 1% de SQR e amostra SIB1. SQR Média (%) +0,67 SIB1 +0,30 5.2.10 Cromatografia em camada delgada (CCD) A técnica por CCD permite a separação de impurezas da amostra, bem como sua identificação em comparação com uma substância de referência (COLLINS, 1997). 75 __ __________ 6. Conclusões A análise por CCD requer materiais simples e pode ser utilizada em farmácias magistrais. Por este motivo, no desenvolvimento da técnica de identificação do cloridrato de sibutramina por CCD, priorizou-se o uso de reagentes disponíveis nas farmácias e que não sejam insalubres (BRASIL , 1978). Diversas condições cromatográficas foram testadas. O método mais adequado está descrito no item 4.2.9 (p. 41). Como substâncias de comparação, foram testadas algumas aminas alifáticas com estrutura semelhante à sibutramina. No sistema cromatográfico selecionado, o cloridrato de diltiazem (Figura 10) apresentou um melhor perfil. Diferentes proporções de solventes foram avaliadas para constituir a fase móvel, tais como: metanol, etanol, acetona e acetato de etila. Entre essas, escolheuse o etanol puro, pois nesse solvente a migração da substância foi satisfatória. A revelação das manchas foi possível tanto por vapores de iodo quanto por lâmpada UV 254 nm. Na Figura 11 são representadas as placas cromatográficas obtidas, com análises simultâneas da SQR, da amostra SIB1, conteúdo de CAP, bem como da substância de comparação cloridrato de diltiazem. O S O N CH3 CH3 O O H3C N CH3 .HCl Figura 10. Estrutura química do cloridrato de diltiazem. 76 __ __________ 6. Conclusões DIL SQR SIB1 CAP (A) (B) Figura 11. Placa cromatográfica obtida por CCD para a substância de referência cloridrato de diltiazem (DIL), SQR, amostra SIB1 e CAP. Fase estacionária: cromatoplacas de gel de sílica GF 254 Merck. Fase móvel: etanol P.A. Revelação: lâmpada UV 254 nm (A) e vapores de iodo (B). Os valores de Rf corresponderam a 0,73 ±0,015 para SQR e amostras SIB1 e CAP, enquanto para o cloridrato de diltiazem esse foi de 0,34 ±0,01. Assim, para SQR, SIB1, e CAP o Rx calculado foi de 2,15 ±0,11. Verificaram-se perfis cromatográficos semelhantes entre SQR, amostras SIB1 e CAP, o que indica que elas contêm a mesma molécula. O método foi capaz de diferenciar o cloridrato de sibutramina da substância de comparação cloridrato de diltiazem, um sal de amina alifática terciária. Portanto, o método foi considerado seletivo em relação ao fármaco em análise. 77 __ __________ 6. Conclusões 5.2.11 Espectroscopia na região do infravermelho (IV) Esse método é capaz de identificar moléculas orgânicas complexas, com elevada especificidade, exceto para isômeros ópticos. Pequenas impurezas não interferem significativamente no espectro, mas algumas características como polimorfismo, variação e tamanho dos cristais e formação de hidratos, podem originar diferenças (F. Bras. IV, 1988; SILVERSTEIN, 2000; WATSON, 2005). Os espectros de absorção na região do infravermelho obtidos para a SQR e SIB1 (Figura 12) apresentaram as mesmas bandas. A análise realizada para SIB2 e SIB3 também resultou em espectros semelhantes. Porta nto, concluiu-se que a SQR e as amostras avaliadas possuem a mesma identidade química. 1180 3035 1600 Figura 12. Espectros de infravermelho obtidos para o cloridrato de sibutramina monoidratado: SQR (preto) e SIB1 (vermelho). No Quadro 13, são apresentadas as atribuições às principais bandas do espectro que caracterizam a molécula. 78 2950 2850 2700 3400 1080 825 __ __________ 6. Conclusões Realizou-se a análise com a SQR dessecada e não dessecada. A substância dessecada apresentou um espectro com menor ruído. Entretanto, mediante comparação dos espectros obtidos para essas formas, não houve diferenças na posição das bandas características de grupamentos, referidas no Quadro 13. Assim, a água de hidratação da molécula não interfere na sua identificação, desde que sejam comparados os espectros de padrão e amostra na mesma condição (dessecada ou não dessecada). Quadro 13. Atribuições às principais bandas do espectro de infravermelho para o cloridrato de sibutramina monoidratado (NAKANISHI e SOLOMON, 1977; SILVERSTEIN, 2000). Número de Onda (cm-1) 3400 3.035 2.950 a 2.850 2.700 1.600 e 1490 1.180 1.080 825 Atribuição Deformação axial de N-H do sal de amina Deformação axial de C-H em alquenos Deformação axial de C-H em alcano e cicloalcano Deformação axial de N-H do sal de amina Deformação axial de C=C do anel aromático Deformação axial de C-N da amina Deformação axial de C-Cl do clorobenzeno Deformação angular C-H do anel aromático para-substituído 5.2.12 Espectroscopia na região do ultravioleta (UV) Este método possibilita a identificação de moléculas com sistemas conjugados, porém, isoladamente, apresenta especificidade reduzida (KOROLKOVAS, 1988; SILVERSTEIN, 2000). Esse parâmetro depende dos grupos cromóforos presentes na molécula do fármaco (WATSON, 2005). Obtém-se mais segurança para identificação do fármaco através desse método mediante comparação entre os espectros obtidos para a amostra e substância de referência, além da realização de técnica alternativa, como uma reação de caracterização. 79 __ __________ 6. Conclusões Os espectros obtidos foram satisfatórios nos três solventes avaliados (metanol, etanol e solução de ácido clorídrico 0,1 M) e nas concentrações de 10 e 20 µg/mL. Entre esses, optou-se por etanol, uma vez que esse solvente satisfaz as condições necessárias de completa solubilização do fármaco e não é insalubre em baixas quantidades (BRASIL, 1978). Na Figura 13 são apresentados os espectros obtidos com os três solventes testados. Na Figura 14 é realizada a comparação entre a SQR e a SIB1. 0,500 Abs. 0,000 200,0 250,0 300,0 Comprimento de onda (nm) 350,0 400,0 Figura 13. Espectros obtidos na região do ultravioleta para a SQR do cloridrato de sibutramina em solução, diluído nos solventes: ácido clorídrico 0,1 M (preto), metanol (azul) e etanol (vermelho). Todos solventes resultaram em espectros idênticos e com o mesmo comprimento de onda de absorção máxima, ou seja, correspondente a 223 nm. Pode-se observar que os perfis dos espectros de SQR e SIB1 são semelhantes. Assim, confirmou-se a identidade da molécula. 80 __ __________ 6. Conclusões 0,500 Abs. 0,000 200,0 250,0 300,0 350,0 Comprimento de onda (nm) 400,0 Figura 14. Espectros obtidos na região do ultravioleta para SQR e SIB1, em solução etanólica. 5.2.13 Aquametria A determinação da umidade foi realizada por dois métodos, sendo também comparada com os resultados obtidos pelo TGA (item 5.2.6, p. 71). 5.2.13.1 Método volumétrico por Karl-Fischer O método original por Karl-Fischer realiza uma titulação entre a água e uma solução anidra de iodo e dióxido de enxofre, dissolvida em metanol e piridina (F. Bras. IV, 1988). Entretanto, o último reagente apresenta odor forte e é tóxico (BRASIL, 1978). Assim, alguns equipamentos, como o DL 37 Mettler Toledo utilizado neste trabalho, requerem o uso de uma solução sem a piridina. A massa de amostra pesada para a análise (30 mg) foi escolhida conforme a recomendação no manual do equipamento, descrita no Quadro 14 (ANEXO). Os 81 __ __________ 6. Conclusões resultados obtidos em três dias diferentes são apresentados na Tabela 8. Os três dias de análise estão separados entre si por ao menos cinco meses. Os DPR entre as análises realizadas em diferentes dias foram baixos, o que indica que, apesar de ser monoidratada, a molécula mantém estável o seu teor de água ao longo do tempo, quando acondicionada em condições adequadas. Tabela 8. Resultados obtidos para a determinação da aquametria pelo método de KarlFischer, para SQR e SIB1, em três dias diferentes. SQR Média* (%) Dia 1 Intradias Dia 2 Dia 3 Entre dias 5,48 5,65 5,56 5,54 DPR (%) 0,46 1,00 0,25 1,65 Média* (%) 5,47 5,63 5,62 5,58 SIB1 DPR (%) 0,53 0,18 0,50 1,46 * Média de três determinações. Os resultados obtidos foram conforme o esperado para a molécula monoidratada, ou seja, entre 5 e 6%. Os valores obtidos por esse método diferiram pouco em relação àqueles obtidos por TGA, ou seja, correspondente a 6,01% e 5,86% para SQR e SIB1, respectivamente. Apesar da semelhança nos resultados, sabe-se que o método de Karl-Fischer representa o método mais exato para a aquametria, já que é baseado na titulação da água, não envolvendo perdas de substâncias voláteis, como é possível nos métodos térmicos. 82 __ 5.2.13.2 Método gravimétrico __________ 6. Conclusões Esse método é de realização simples e requer o uso de estufa, um equipamento freqüentemente disponível em farmácias magistrais. Contudo, esse método não é viável, se o fármaco apresentar termolabilidade (F. Bras. IV, 1988). A F. Bras. IV (1988) recomenda que para amostras que se decompõem na temperatura indicada para a análise, pode-se realizar a secagem a vácuo, numa temperatura mais baixa. Entretanto, esse método não é viável para a maioria das farmácias magistrais, em virtude da ausência do equipamento necessário. Sendo assim, outras condições foram testadas. Os resultados obtidos em cada condição testada estão relatados na Tabela 9. Tabela 9. Resultados obtidos para a determinação da aquametria pelo método gravimétrico, para SQR e SIB1, sob diferentes condições. SQR Condição Média (%) 120 °C por 3 horas** 110 ºC por 2 horas* 105 °C por 1 hora* 105 °C por 2 horas* 105 °C por 3 horas* * Média de três determinações. ** Uma determinação. SIB1 DPR (%) 6,11 1,32 1,83 4,36 Média (%) 11,9 7,51 5,68 5,88 6,03 DPR (%) 5,27 0,99 2,16 6,95 10,21 6,10 5,93 6,27 6,41 Considerando que o fármaco possui uma molécula de água de hidratação, esperava-se que fosse necessária uma temperatura superior a 105 ºC para a 83 __ __________ 6. Conclusões realização de perda por dessecação. Assim, foram avaliadas as temperaturas de 110 ºC e 120 ºC, por duas e três horas, respectivamente. A temperatura de 120 ºC foi demasiadamente drástica para a amostra, havendo perda de massa superior a 6%. Nesse caso, houve perda de material volátil, provavelmente de um produto de degradação produzido em elevada temperatura, o que também foi evidenciado mediante análise de uma amostra por TGA (item 5.2.6, p. 70). A verificação na temperatura de 110 ºC apresentou uma perda de massa menor que o método anterior, mas acima de 6%. Por isso, ambos os método foram considerados inadequados. Assim, testou-se o método com a temperatura de 105 ºC, por uma, duas e três horas. Observou-se uma perda de massa crescente a cada hora, ultrapassando o limite máximo de 6% após duas horas para SQR e três horas para SIB1. Além disso, em ensaios realizados a 105 °C por duas horas com outras amostras do fármaco, porém não utilizadas no presente trabalho, a perda por dessecação foi inferior a 5%. Sabe-se que a perda de água está relacionada à estrutura polimórfica da molécula e, conforme demonstrado no item 5.2.5 (p. 66), é possível que as amostras de cloridrato de sibutramina analisadas apresentem polimorfismo. Frente a isso, diferentes formas polimórficas de uma mesma molécula podem perder a sua água de hidratação em temperaturas, que diferem entre si em alguns graus Celsius. No entanto, se forem seguidos alguns cuidados, pode-se realizar a perda por dessecação na temperatura de 105 °C em farmácias magistrais. Dessa forma, sugere-se que a perda por dessecação seja realizada nessa temperatura por uma hora. Se houver perda de massa inferior à faixa de especificação, deve-se repetir o procedimento por mais uma hora, totalizando duas horas. Ademais, considerando-se a complexidade e o erro inerente ao método gravimétrico para a determinação de um valor exato para o teor de água, pode-se estabelecer uma especificação de pureza entre 98 e 102% do fármaco. 84 __ 5.3 ANÁLISE QUANTITATIVA __________ 6. Conclusões A análise quantitativa é realizada para determinar o teor do analito em uma amostra. Para o doseamento de fármacos em amostras de matéria-prima ou produto acabado, o procedimento analítico empregado deve ser adequadamente validado (ICH, 2005). Para possibilitar a realização de doseamento do fármaco em farmácias magistrais, foi desenvolvido um método por volumetria em meio não-aquoso (VMNA). A avaliação da exatidão desse método foi por uma comparação com um segundo método (CLAE), o qual foi validado de acordo com a legislação brasileira (BRASIL, 2003 b) e com o ICH (2005). 5.3.1 Volumetria em meio não-aquoso (VMNA) A VMNA é amplamente recomendada em monografias farmacopéicas para o doseamento de fármacos (BP 2007; BUVÁRI-BARCZA e BARCZA, 2005; F. Bras. IV, 1988; F. Bras. IV, 2006; Ph. Eur., 2005; USP 30, 2007). Além disso, essa técnica é rápida, exata e requer aparelhagem simples. Sendo assim, é o método de escolha por muitos laboratórios, inclusive aqueles de controle de qualidade em farmácias magistrais. A técnica por VMNA é utilizada para quantificar fármacos que sejam ácidos ou bases fracas, abrangendo, entre as últimas, alguns sais de aminas (F. Bras. IV, 1988; KOROLKOVAS, 1988; WATSON, 2005). Quimicamente, o cloridrato de sibutramina é classificado como um sal de amina terciária (Figura 1, p.18), sendo, portanto, possível o seu doseamento por VMNA. Nos cloridratos de aminas, é usual a titulação com o ácido perclórico diluído em ácido acético glacial (Esquema 2). O ânion cloreto do fármaco, porém, é uma base extremamente fraca para reagir quantitativamente com o ácido perclórico em ácido acético. Conseqüentemente, para o doseamento por VMNA desses fármacos, as farmacopéias preconizam a adição de acetato mercúrico (F. Bras. IV, 1988; USP 85 __ __________ 6. Conclusões 30, 2007). Dessa forma, o ânion cloreto é quantitativamente substituído pelo acetato produzido (Esquema 3), sendo o último uma base forte em solução de ácido acético e passível de reação quantitativa com o titulante (Esquema 4). HClO4 + CH3 -COOH → ClO4- + CH3-COOH2+ Esquema 2 2Cl- + Hg(CH3-COO)2 → HgCl2 + 2CH3 -COOEsquema 3 2CH3-COOH2+ + 2CH3-COO- → 4CH3-COOH Esquema 4 Entretanto, o acetato mercúrico é um produto insalubre em grau máximo (BRASIL, 1978), por conter um metal pesado de elevada toxicidade (BRASIL, 2004; BUVÁRI-BARCZA e BARCZA, 2005). Considerando a repercussão do uso desse reagente quanto aos aspectos trabalhistas e ambientais, é primordial que os laboratórios priorizem o uso de técnicas analíticas com química limpa (LENARDÃO et al, 2003; PRADO, 2003). Atualmente, como alternativa ao uso do acetato mercúrico, a Farmacopéia Japonesa e algumas referências na literatura sugeriram o uso de uma mistura de anidrido acético e ácido acético glacial (BUVÁRI-BARCZA e BARCZA, 2005). Nesses casos, os resíduos formados são constituídos de ácido acético glacial, o qual é mais facilmente descartado, além de não apresentar insalubridade (BRASIL, 1978; BRASIL, 2004). 86 __ __________ 6. Conclusões Por outro lado, o excesso de anidrido acético pode acilar as aminas primárias ou secundárias, obtendo-se uma baixa recuperação (KOROLKOVAS, 1988). No entanto, para o cloridrato de sibutramina monoidratado, um sal de amina terciária, não há este risco (BUVÁRI-BARCZA e BARCZA, 2005). O ácido acético glacial apresenta variação do volume, em função do coeficiente de dilatação temperatura dependente. A temperatura durante a realização das análises variou entre 18 e 23 °C. Portanto, efetuou-se a correção do volume de titulante gasto na bureta através da equação 3 (F. Bras. IV, 1988). Equação 3 Vc = V g . [1 + (t1 – t2 ) . 0,0011] Onde: Vc = volume corrigido; Vg = volume gasto na bureta, descontando o volume gasto no ensaio em branco; t1 = temperatura ambiente no momento da padronização do titulante; t2 = temperatura ambiente no momento da titulação da amostra; 0,0011 = coeficiente de expansão cúbica do ácido acético glacial. Considerando o problema da geração de resíduo tóxico, compararam-se os métodos com o uso de acetato mercúrico (métodos 1, 2 e 3) e anidrido acético (métodos 4, 5 e 6), frente a diferentes indicadores de ponto final. Os resultados obtidos para cada método estão apresentados na Tabela 10. Os DPR obtidos para os seis métodos foram inferiores a 1%. Assim, os resultados dos métodos 1 a 6 são considerados reprodutíveis. 87 __ __________ 6. Conclusões A comparação estatística entre esses resultados foi realizada considerando os diferentes números de repetições e está apresentada no Tabela 19 do ANEXO. Não houve diferença significativa entre os resultados obtidos pelos seis métodos (Fcal< Ftab), sendo eles intercambiáveis. Assim, recomenda-se preferentemente os métodos 4 e 5. Afinal, esses últimos não requerem reagentes tóxicos, como nos métodos 1 a 3, nem potenciômetro, como no método 6. A análise de variância (ANOVA) entre os métodos 4 e 5 e o método por CLAE é apresentada no item 5.4 (p. 102). Tabela 10. Comparação dos teores de SIB1 obtidos através de diferentes métodos de VMNA, calculados em relação à substância seca. n 1 2 3 4 5 6 7 8 Média (%) DPR (%) Método 1 98,91 98,96 99,06 99,74 99,77 99,29 0,43 Método 2 99,43 99,44 99,61 99,78 100,45 99,74 0,42 Método 3 98,44 98,55 98,97 99,72 100,16 99,17 0,75 Método 4 98,36 99,24 99,61 99,78 100,64 99,53 0,83 Método 5 99,00 99,42 99,67 100,43 100,58 99,82 0,67 Método 6 99,00 99,39 99,90 100,09 100,64 100,70 101,04 101,06 100,23 0,53 5.3.2 Cromatografia líquida de alta eficiência A técnica por CLAE constitui um processo de separação, identificação e doseamento dos constituintes de uma amostra; é uma técnica amplamente empregada para a quantificação de fármacos puros e em formulações (BP 2007; F. 88 __ __________ 6. Conclusões Bras. IV, 1996; KAZAKEVICH e LOBRUTTO, 2007; Ph. Eur., 2005; USP 30, 2007; WATSON, 2005). Na literatura, já existem alguns métodos por CLAE validados para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado em matrizes biológicas, matéria-prima e cápsulas, conforme descritos nos itens 3.3.4 e 3.3.5 (p. 28 e 30, respectivamente) (CHEN et al, 2002; DING et al, 2003; HIND et al, 1999; RADHAKRISHNA, 2000; SEGAL et al, 2003; XIAO, 2005). O desenvolvimento do método por CLAE utilizado no presente trabalho teve como base aqueles métodos. Priorizou-se o uso de uma fase móvel sem tampão. Apesar do teor de silanóis livres na coluna utilizada ser baixo, preferiu-se o uso de trietilamina na composição da fase móvel para uma melhora na assimetria dos picos cromatográficos. Isso é justificado devido ao fato da molécula do fármaco ser uma amina que pode ficar adsorvida aos grupamentos silanóis livres presentes na coluna de fase reversa, ocasionado o alargamento do pico. Com a adição de trietilamina, os grupamentos silanóis interagem preferentemente com ela e há otimização dos parâmetros do sistema (KAZAKEVICH e LOBRUTTO, 2007). Primeiramente, procurou-se adaptar o método descrito por SEGAL e colaboradores (2003). Nesse, utilizou-se fase móvel contendo metanol e água (80:20 V/V), adicionada de 0,3% de trietilamina, com pH 4,5 e uma coluna C18. No entanto, o cromatograma obtido por este método apresentou um pico com assimetria de aproximadamente 2,0, considerada inadequada para as análises (FDA, 1994). Da mesma forma, outros ensaios realizados com metanol na fase móvel, com diferentes colunas C 18 não apresentaram resultados satisfatórios. Testaram-se, também, diferentes pH da água para o preparo da fase móvel, sendo eles: 3,0; 4,5; 7,0. Os melhores parâmetros foram obtidos com o pH 7,0. Isso pode ser justificado em função do pKa estimado para o fármaco em estudo, que é de 9,6 de acordo com o aplicativo ALOGPS 2.1 (VCCLAB, 2007). Então, em pH 7,0 o fármaco está quase 100% ionizado, satisfazendo a condição desejável quanto à predominância de uma das formas de ionização (KAZAKEVICH e LOBRUTTO, 2007; WATSON, 2005). 89 __ __________ 6. Conclusões Posteriormente, testou-se um método adaptado de RADHAKRISHNA e colaboradores (2000), mediante o uso de uma fase móvel contendo acetonitrila e água (75:25 V/V), com pH 7,0, fluxo 2,0 mL/min e uma coluna C18. Esse ensaio, porém, resultou em um cromatograma com um pico com retenção de 22 minutos. Esse tempo é demasiadamente longo para a realização de análises de rotina. Assim, obteve-se êxito mediante a troca da coluna citada no último método por uma C8 e mantendo-se as demais condições descritas no Quadro 10 (p. 47). Para o doseamento da matéria-prima e na forma de cápsulas (CAP), obteve-se cromatogramas com pico com retenção de aproximadamente 7,8 minutos, conforme apresentado na Figura 15. Os parâmetros cromatográficos para o pico correspondente ao fármaco, pelo método desenvolvido por CLAE, estão em conformidade com aqueles preconizados pelo FDA (1994) e são apresentados na Tabela 11. 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 Minutos 6 8 10 Figura 15. Cromatogramas obtidos para SQR (preto), SIB1 (vermelho), CAP (azul) 60 µg/mL e excipientes de CAP (verde), diluídos na fase móvel, de acordo com o método desenvolvido por CLAE. Condições de análise: coluna Macherey-Nagel N ucleosil ® C8 ec, 150 x 4,0 mm, partículas 5 µm, poros 100 ?; fase móvel: ACN e água (75:25 V/V), 0,3% trietilamina, pH 7,0 (H3PO4); λ = 225 nm; fluxo 1,2 mL/min. 90 __ __________ 6. Conclusões Tabela 11. Avaliação dos parâmetros cromatográficos, para o método desenvolvido por CLAE, para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado. Resultados Parâmetro Recomendado* Tempo de retenção (tR ) Fator de capacidade (k’) Resolução (Rs) Assimetria (TF) Número de pratos teóricos (N) * FDA (1994) e SHABIR, 2003. Método Desenvolvido 7,53 6,3 1,20 3400 > 2,0 > 2,0 = 2,0 > 2000 5.3.2.1 Especificidade A especificidade avalia a capacidade do método em medir exatamente o analito na presença de outros componentes tais como impurezas, produtos de degradação de componentes da matriz. Quando a(s) impureza(s) ou o(s) produto(s) de degradação não estiverem disponíveis, pode-se provocar a formação desses submetendo-se o fármaco a condições de estresse (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). As condições de estresse empregadas para originar os produtos de degradação do cloridrato de sibutramina foram: temperatura, luz, umidade, hidrólise ácida, hidrólise alcalina e oxidação. 5.3.2.1.1 Temperatura Conforme pode ser verificado na Figura 16, não houve a formação de produtos de degradação quando a SQR e o fármaco presente no conteúdo de CAP foram submetidos à temperatura de 80 °C, durante 24 horas. A pureza dos picos obtidos foi de 1,0, tanto para o fármaco em SQR quanto em CAP. 91 __ __________ 6. Conclusões 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 Minutos 6 8 10 Figura 16. Cromatograma da solução de SQR (preto) e CAP (vermelho) 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, após serem submetidas à temperatura de 80 ºC, durante 24 horas, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 (p. 47). 5.3.2.1.2 Luz ultravioleta O ensaio em branco realizado paralelamente com a solução protegida da incidência da luz ultravioleta foi realizado para verificar se a degradação ocorre exclusivamente devido à exposição do fármaco à radiação ultravioleta. Assim, elimina-se a possibilidade da interferência do leve aquecimento gerado pela lâmpada. Observou-se que o fármaco na solução protegida da radiação (branco) não sofreu degradação, enquanto que para uma solução da SQR exposta por 24 horas à lâmpada ultravioleta de 254 nm foram observados dois picos secundários, caracterizando a formação de produtos de degradação. O pico principal, característico do cloridrato de sibutramina, apresentou pureza de 0,999. Nessas condições, o teor da SQR reduziu para cerca de 80%. Os respectivos cromatogramas são apresentados na Figura 17. 92 __ __________ 6. Conclusões As áreas dos picos secundários observados, nos t R 5,5 e 6,3 minutos, representam 0,4 e 0,7% do pico principal respectivamente. Além disso, seus tR são inferiores ao do cloridrato de sibutramina, indicando que os produtos formados são mais polares que o produto original. 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 Minutos 6 8 10 Figura 17. Cromatograma da SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel, sem incidência de radiação (preto) e após ser submetido à luz ultravioleta 254 nm durante 24 horas (vermelho), conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10 (p. 47). 5.3.2.1.4 Hidrólise ácida O fármaco, submetido ao meio ácido durante duas horas, não apresentou picos sugestivos de degradação (Figura 18). Além disso, não foi observada redução do teor do fármaco em SQR e em CAP. A pureza do pico do fármaco em SQR foi de 1,0 e em CAP foi de 0,999. 93 __ __________ 6. Conclusões 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 6 8 10 Minutos Figura 18. Cromatogramas obtidos após hidrólise ácida durante duas horas para: cloridrato de sibutramina em soluções 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, de SQR (preto) e de CAP (vermelho); branco (azul). Análise conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10. 5.3.2.1.5 Hidrólise alcalina Após duas horas de reação de hidrólise em meio alcalino, o teor da SQR do fármaco foi reduzido para cerca de 98%. Não foi observado, porém, o aparecimento de picos secundários correspondentes a produtos de degradação. Os cromatogramas obtidos são apresentados na Figura 19. A pureza obtida para os picos correspondentes ao fármaco em SQR e em CAP foi de 1,0. 94 __ __________ 6. Conclusões 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 6 8 10 Minutos Figura 19. Cromatogramas obtidos após hidrólise alcalina durante duas horas para: cloridrato de sibutramina em soluções 60 µg/mL, diluídas em fase móvel, de SQR (A) e de CAP (B); branco (C). Análise conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10. 5.3.2.1.6 Oxidação Verificou-se um pico secundário com o t R maior que o principal, provavelmente devido à formação de um produto menos polar que a sibutramina. No tR de dois minutos é observado um pico com elevada absorção, o qual é atribuído ao conservante utilizado no peróxido de hidrogênio. Houve uma redução considerável do teor após duas horas de reação para aproximadamente 69%. O pico correspondente à SQR apresentou pureza de 0,999 e a sua resolução em relação ao pico próximo é de 4,8. Os cromatogramas são apresentados na Figura 20. 95 __ __________ 6. Conclusões 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 6 8 10 Minutos Figura 20. Cromatograma da solução de cloridrato de sibutramina monoidratado 60 µg/mL, diluída em fase móvel, após oxidação com peróxido de hidrogênio 3% durante duas horas. Análise de SQR (preto), CAP (vermelho) e branco (azul), conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10. 5.3.2.1.7 Solução simulada de excipientes Para verificar se há interferência dos excipientes na determinação do cloridrato de sibutramina em CAP, analisou-se uma solução simulada com os mesmos. As concentrações finais de cada um deles foram escolhidas considerando aquelas correspondentes a uma solução contendo 60 µg/mL do fármaco em CAP. A proporção de cada excipiente foi definida de acordo com sua quantidade usual na forma farmacêutica cápsulas (KIBBE, 2000). Conforme comparação entre o cromatograma obtido para os excipientes e o do cloridrato de sibutramina na forma farmacêutica (CAP), não há interferência dos primeiros na determinação do fármaco. Além disso, a pureza do pico para o fármaco em CAP foi de 1,000 (Figura 15, p. 90). 96 __ 5.3.2.2 Linearidade __________ 6. Conclusões A linearidade de um método corresponde à sua capacidade de demonstrar que os resultados obtidos são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, num intervalo especificado (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). As áreas correspondentes às concentrações utilizadas para cada uma das três curvas são apresentadas na Tabela 20 (ANEXO). O gráfico correspondente à curva padrão obtida com sete concentrações é mostrado na Figura 21. O coeficiente de correlação (r) para a curva resultante foi de 0,99999, estando de acordo com o critério mínimo aceitável de 0,99 (BRASIL, 2003 b). Conclui-se, então, que o método de CLAE resulta em áreas correlacionadas à concentração do fármaco. 3500000 3000000 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 0 Área absoluta y = 33340x + 1995632 r = 0,99999 20 Concentração (µg/mL) 40 60 80 100 Figura 21. Representação gráfica da curva padrão obtida para o cloridrato de sibutramina monoidratado por CLAE, conforme método descrito no Quadro 10 (p. 47). A análise de variância (ANOVA) para os resultados obtidos nas três curvas padrão é demonstrada na Tabela 21 (ANEXO). Comprovou-se que há regressão linear significativa (Fcalc > Ftab) e não há desvio da linearidade (Fcalc < Ftab) no método por CLAE. 97 __ __________ 6. Conclusões 5.3.2.3 Limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) O limite de detecção (LD) de um método analítico equivale à menor quantidade do analito que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada. Enquanto o limite de quantificação (LQ) corresponde à menor quantidade do analito que pode ser quantificada com exatidão e precisão (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). De acordo com os códigos oficiais (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007), o LD e o LQ podem ser calculados por equações (item 4.3.2.3, p. 50), com os dados da linearidade. Para o cálculo foram utilizados o coeficiente de regressão linear (33340) e o desvio padrão do intercepto (23102), ambos obtidos a partir da curva padrão média. Então, considerando-se esses dados, estimou-se que: LD = 2,29 µg/mL e LQ = 6,93 µg/mL. 5.3.2.4 Precisão A precisão avalia a proximidade dos resultados obtidos em uma série de medidas de uma amostragem múltipla de uma mesma amostra. A repetibilidade avalia a concordância entre os resultados dentro de um curto período com o mesmo analista e mesma instrumentação. Já a precisão intermediária considera os mesmos parâmetros, porém em dias diferentes (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005). Os resultados obtidos, para a repetibilidade e precisão intermediária na quantificação do cloridrato de sibutramina como matéria-prima (SIB1) e cápsulas (CAP), são apresentados nas Tabelas 12 e 13, respectivamente. Para os cálculos dos teores, as áreas das amostras foram comparadas às áreas obtidas para SQR. De acordo com os DPR obtidos para a análise do fármaco como matéria-prima e cápsulas, o método foi considerado preciso. 98 __ __________ 6. Conclusões Tabela 12. Resultados obtidos para a repetibilidade e precisão intermediária, referentes ao método desenvolvido por CLAE para o doseamento do cloridrato de sibutramina na forma de matéria-prima (amostra SIB1). n 1 2 3 4 5 6 Repetibilidade Média (%) Dia 1 Dia 2 Dia 3 100,71 100,24 99,41 100,79 100,06 99,69 100,89 100,64 99,86 100,47 99,89 100,67 100,66 99,10 101,24 101,36 99,21 100,64 100,81 99,86 100,25 100,31 0,30 0,60 0,71 0,42 DPR (%) Precisão intermediária Tabela 13. Resultados obtidos para a repetibilidade e precisão intermediária, referentes ao método desenvolvido por CLAE para o doseamento do cloridrato de sibutramina na forma de produto acabado (amostra CAP). n 1 2 3 4 5 6 Repetibilidade Média (%) Dia 1 Dia 2 Dia 3 94,68 92,93 92,70 92,57 96,65 90,80 92,58 95,71 91,54 94,60 95,33 91,51 93,23 92,51 92,45 92,91 94,91 91,01 93,42 94,67 91,67 93,25 1,03 1,71 0,80 1,62 DPR (%) Precisão intermediária 5.3.2.5 Exatidão A exatidão do método analítico considera a proximidade dos resultados obtidos por ele em relação ao valor aceito como verdadeiro (BRASIL, 2003 b; ICH, 2005; USP 30, 2007). O método por CLAE desenvolvido para a determinação de matéria-prima foi considerado exato na faixa de 30 a 90 µg/mL, conforme inferência estabelecida com relação à precisão, linearidade e especificidade previamente determinadas (ICH, 2005). 99 __ __________ 6. Conclusões De acordo com o ICH (2005), a exatidão para produto acabado pode ser expressa como percentual de recuperação. Tais dados foram obtidos pelo doseamento de soluções da amostra CAP adicionadas de quantidades conhecidas da SQR e esses são apresentados na Tabela 14. A recuperação média obtida foi de 101,21%, demonstrando que o método desenvolvido por CLAE é exato para a determinação do teor do fármaco em cápsulas. Tabela 14. Resultados da recuperação do cloridrato de sibutramina em cápsulas. Concentração SQR (µg/mL) Adicionada A1 10,00 Recuperada 9,94 10,23 10,28 20,12 20,24 20,38 30,39 30,21 30,21 Recuperação (%) 99,40 102,30 102,80 100,60 101,20 101,90 101,30 100,70 100,70 Recuperação média (%) Média (%) 101,50 A2 A3 20,00 101,23 30,00 100,90 101,21 5.3.2.6 Robustez A robustez de um método é a avaliação de sua capacidade em resistir a pequenas alterações dos parâmetros analíticos (BRASIL, 2003 b; ICH 2005). A solução de SQR manteve-se estável após armazenamento durante oito horas em temperatura e luz ambiente. Antes dessa condição, o teor obtido para a amostra SIB1 foi de 100,31% e após foi de 100,08%. Os parâmetros cromatográficos obtidos em cada condição avaliada e os resultados para a concentração da amostra SIB1 constam na Tabela 15. Os últimos valores foram calculados em relação à área da SQR em análise concomitante. O método desenvolvido por CLAE demonstrou-se robusto. Apenas o tempo de 100 __ __________ 6. Conclusões retenção foi afetado pela mudança de parâmetros sendo a alteração da fase móvel para ACN:água 73:27 (V/V) a que mais influenciou na alteração do mesmo. Tabela 15. Parâmetros cromatográficos e teor da amostra SIB1 para variações do método desenvolvido por CLAE para o cloridrato de sibutramina. Teor de Modificação SIB1 (%)* 100,31 100,08 100,11 99,80 100,24 99,76 100,38 tR N TF k' Normal Fase móvel com pH 6,8 Fase móvel com pH 7,2 Fase móvel ACN:água 73:27 Fase móvel ACN:água 77:23 Coluna Shimadzu** Outro equipamento 7,53 7,90 7,42 8,18 7,18 7,12 7,70 3400 3800 3500 3900 3600 4400 3320 1,20 1,23 1,23 1,21 1,22 1,30 1,15 6,3 6,6 6,1 6,8 6,7 6,1 6,72 * Cada valor é correspondente à área média de três injeções, calculada em relação à área obtida para análise da SQR nas mesmas condições. ** Coluna C8 150 x 4,0 mm, partículas 5 µm, poros 100 ? . tR = tempo de retenção, em minutos; N = número de pratos teóricos; TF= assimetria; k’= fator de capacidade 5.3.3 Comparação estatística entre os métodos de doseamento Os métodos 4 e 5 por VMNA, com uso da mistura ácido acético e anidrido acético e cujos indicadores de ponto final foram cristal violeta e naftolbenzeína, respectivamente, foram julgados mais adequados para a determinação quantitativa (item 5.3.1, p. 85). Os teores obtidos para esses dois métodos sugeridos e para a CLAE são apresentados na Tabela 16. A comparação por análise de variância (ANOVA) está na Tabela 22, em ANEXO. Para a avaliação estatística, foram considerados os diferentes números de repetições entre os métodos. Não houve diferença significativa entre os métodos 101 __ __________ 6. Conclusões avaliados, demonstrando que eles são intercambiáveis (p<0,05). Dessa forma, os métodos 4 e 5 são considerados adequados e exatos para a determinação quantitativa do cloridrato de sibutramina em farmácias magistrais. Tabela 16. Comparação dos resultados dos teores obtidos por CLAE e pelos métodos 4 e 5 por VMNA. CLAE n Média (%) DPR (%) 18 100,31 0,42 VMNA Método 4 5 99,53 0,83 VMNA Método 5 5 99,62 0,67 Presume-se que os métodos desenvolvidos por VMNA possam ser utilizados para o doseamento do cloridrato de sibutramina monoidratado em cápsulas manipuladas. No entanto, as farmácias possuem excipientes diferentes entre si. Assim, cabe a cada uma delas, mediante interesse, validar o método em seu estabelecimento. Sabe-se que alguns excipientes, como o estearato de magnésio, reagem com o ácido perclórico em meio não-aquoso. Dessa forma, antecipa-se que é necessária a realização de um ensaio em branco com a quantidade de excipientes equivalente à massa de conteúdo pesada. O volume de titulante gasto para análise do branco deve ser descontado do volume gasto para a amostra. 5.4 ESTUDO PRELIMINAR DE ESTABILIDADE O estudo preliminar de estabilidade é útil para verificar se há degradação do fármaco quando ele é submetido a condições de estresse. A avaliação preliminar do estudo de estabilidade de um fármaco é acelerada, sendo posteriormente verificada 102 __ __________ 6. Conclusões em longa duração. O comportamento do fármaco deve ser acompanhado por metodologia validada e sensível à detecção de moléculas similares ao fármaco (ICH, 2003). Frente à inexistência de informações referentes à estabilidade do cloridrato de sibutramina monoidratado, neste trabalho foi realizado tal estudo. O fármaco foi submetido à temperatura e à radiação UVA e UVB, condições preconizadas pelo ICH (2003). 5.4.1 Exposição à temperatura elevada A estabilidade térmica (60 ºC) foi avaliada numa temperatura inferior à utilizada para o ensaio de especificidade na validação do método por CLAE (80 ºC, descrita no item 4.3.2.1.1, p. 47). Optou-se por 60 ºC para avaliação da estabilidade com o intuito de avaliar uma temperatura geralmente empregada nestes estudos( ICH, 2003). Os resultados dos teores obtidos para a SQR exposta em estado sólido à temperatura de 60 ºC, durante vários tempos, são apresentados na Tabela 17. Após 4 dias de exposição a essa condição foi verificada a redução do teor da SQR para 95,47%. Tabela 17. Teores de SQR após ser submetida em estado sólido à temperatura de 60 °C, em diferentes tempos. Tempo de exposição (dias) 1 2 4 10 *Média de três injeções. Teor (%)* 99,56 99,16 95,47 93,70 DPR (%) 0,16 0,14 0,08 0,28 103 __ __________ 6. Conclusões Observou-se um pico secundário no cromatograma obtido por CLAE para a SQR exposta a essa condição apenas após 10 dias (Figura 22). O provável produto de degradação apresentou uma área correspondente a 4,5% em relação à área do cloridrato de sibutramina, além de um tempo de retenção menor, demonstrando ser um composto mais polar. Seu espectro na região do ultravioleta, obtido com auxílio do detector DAD é demonstrado na Figura 23, observando-se que o mesmo é diferente do espectro da sibutramina (item 5.2.12, p. 81). Outros produtos, formados em quantidades pequenas, apresentaram t R abaixo de dois minutos. A avaliação do cloridrato de sibutramina em CAP, exposta à 60 ºC por 10 dias, gerou uma redução de 5,9% em relação ao teor da amostra não degradada. Esse resultado é semelhante ao obtido para a SQR, com a mesma condição, e que está descrito na Tabela 17. 120 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 Minutos 6 8 10 Figura 22. Cromatogramas da solução de cloridrato de sibutramina monoidratado (SQR) 60 µg/mL, diluída em fase móvel, antes (preto) e após ser submetida à temperatura de 60 ºC, durante um (vermelho), dois (azul), quatro (verde) e dez (violeta) dias, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10. 104 __ __________ 6. Conclusões 200 250 300 350 Comprimento de onda (nm) Figura 23. Espectro de UV do pico com tR de três minutos, obtido após exposição da solução de SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel, à radiação UV 254 nm por dez dias. 5.4.1.2 Exposição à radiação ultravioleta O estudo foi realizado em solução porque essa condição permite melhor penetrabilidade da luz em comparação à substância no estado sólido (CONNORS, 1986). Os cromatogramas obtidos para SQR nos diferentes tempos de exposição da solução metanólica à radiação UV 254 nm são apresentados na Figura 24 e os seus respectivos teores na Tabela 18. Verificou-se um decréscimo do teor de SQR mediante exposição à lâmpada UV 254 nm, além de picos secundários nos cromatogramas. Com o aumento do tempo de exposição, observou-se o aumento da área de tais picos e a redução do pico referente ao cloridrato de sibutramina. Observou-se que o pico com tR de três minutos (Figura 22) não aparece sob esta condição de estresse. Em compensação, os picos com tR abaixo de dois minutos apresentam áreas maiores do que aqueles originados pela exposição à temperatura. 105 __ 120 __________ 6. Conclusões 100 80 60 mAU 40 20 0 0 2 4 Minutos 6 8 10 Figura 24. Cromatogramas para SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel, protegida da luz durante quatro dias (preto) e após ser submetida à radiação UV 254 nm, durante um (vermelho), dois (azul) e quatro (verde) dias, conforme condições cromatográficas descritas no Quadro 10. São necessários estudos mais prolongados para uma conclusão definitiva. Entretanto, os estudos preliminares realizados demonstraram que, entre as condições de estresse avaliadas, a radiação UV em 254 nm provoca maior degradação do fármaco. Tabela 18. Teores de SQR 60 µg/mL, diluída em fase móvel, após ser submetida à radiação UV 254 nm, em diferentes tempos. Tempo de exposição (dias) 1 2 4 4 (branco) *Média de três determinações. Teor (%)* 79,20 53,79 5,21 99,87 DPR (%) 0,32 0,33 0,47 0,23 106 6. CONCLUSÕES _________________________________________________________________ __ __________ 6. Conclusões Ø As amostras de matérias-primas do cloridrato de sibutramina monoidratado (SIB1, SIB2 e SIB3) apresentaram conformidade com a SQR, pelas técnicas qualita tivas desenvolvidas: descrição, solubilidade, pH, faixa de fusão, DSC, TGA, reação para cloretos, reação para aminas terciárias, CCD, IV, UV e aquametria; Ø A identificação do cloridrato de sibutramina monoidratado na forma de cápsulas (CAP) é possível pelos métodos: CCD e reação para aminas terciárias; Ø A reação para cloretos, a reação para aminas terciárias, a CCD e a aquametria pelo método gravimétrico são técnicas adequadas para a identificação do fármaco em farmácias magistrais; Ø A análise por DSC das amostras de cloridrato de sibutramina monoidratado indicam a possível existência de diferentes formas polimórficas ou pseudopolimórficas para o fármaco, além dos eventos térmicos de perda de água de hidratação, fusão e volatilização;A análise por Karl-Fischer constitui o método mais exato para a determinação do teor de água no fármaco, demonstrando coerência com o valor de especificação; Ø Para estabelecimentos que não possuam equipamento de Karl-Fischer, recomenda-se a realização da perda por dessecação em estufa a 105 ºC, por uma hora; Ø A análise por TGA indica o teor de água no cloridrato de sibutramina monoidratado; Ø Tanto a SQR e a amostra SIB1 são misturas racêmicas;Os métodos propostos para o doseamento por VMNA utilizaram a mistura de ácido acético glacial e anidrido acético e como indicadores cristal violeta e naftolbenzeína, respectivamente, podendo ser realizados em farmácias magistrais;A quantificação do cloridrato de sibutramina monoidratado por VMNA em produto acabado deve ser validada em cada estabelecimento, considerando os excipientes empregados; Ø O método de doseamento por CLAE se mostrou adequado para a determinação quantitativa do cloridrato de sibutramina monoidratado nas formas de matéria-prima e cápsulas; 109 __ __________ 6. Conclusões Ø O estudo preliminar de estabilidade, realizado mediante exposição do cloridrato de sibutramina monoidratado à temperatura de 60 ºC, mostrou pequena redução de teor do fármaco, além da formação de produtos de degradação, quando avaliado por CLAE; Ø O estudo preliminar de estabilidade, realizado mediante exposição do fármaco à radiação UV 254 nm por até quatro dias, mostrou que este sofre redução considerável do teor, além da formação de produtos de degradação, quando avaliado por CLAE. 110 7. REFERÊNCIAS ___ 7. Referências ABBOTT GMBH & CO. KG (DE). Cloridrato de N,N-dimetil-1-[1 (4 clorofenil) ciclobutil]-3-metilbutilamina monoidratado sólido e composições farmacêuticas contendo o mesmo. BR n. PI1100069-4. 23 de outubro de 1996. Instituto Nacional da Propriedade Industrial. Disponível em . Acesso em 21.02.08. ABBOTT GMBH & CO. KG (DE). 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Especificação do teor de água (%) 50 - 100 10 - 50 1 - 10 0,1 - 1 0,01 - 0,1 0,001 - 0,01 0,0001 - 0,001 Massa de amostra 10 mg 10 - 20 mg 10 - 50 mg 10 - 100 mg 100 mg - 1,0 g 1,0 g - 10 g 10 g - 20 g Tabela 19. Análise de variância (ANOVA) comparando os resultados obtidos pelos seis métodos por VMNA. Fontes de variação Entre Dentro (Erro resíduo) Total gl 5 27 32 SQ 4,7126 12,3271 17,0397 QM 0,9425 0,4566 Fcal 2,0643* Ftab 2,51** * Significativo para p<0,05. ** Determinado por interpolação harmônica entre F.05(5,30) e F.05(5,40). 127 ___ _____ ANEXO Tabela 20. Áreas absolutas dos picos cromatográficos obtidos para cada concentração das três curvas padrão obtidas por CLAE. Concentração (µg/mL) Área absoluta* 993936,72 30,0 990121,69 1014558,55 1322225,12 40,0 1319939,79 1344864,93 1646114,87 50,0 1656056,81 1661028,27 1988051,06 60,0 1996089,76 2003418,17 70,0 2302827,96 2336775,03 2356576,60 2628705,76 80,0 2668430,07 2687539,00 2947738,02 90,0 3012291,69 3030975,48 * Cada valor é correspondente à área média de três injeções. Área média ± e.p.m. DPR (%) 999538,98 ± 7590,09 1,31 1329009,95 ± 7954,89 1,04 1654399,98 ± 4384,10 0,49 1995852,99 ± 4437,68 0,38 2332059,86 ± 15693,99 1,17 2661558,61 ± 17328,01 1,13 2997001,73 ± 25215,45 1,46 128 ___ _____ ANEXO Tabela 21. Análise de variância (ANOVA) para três curvas padrão realizadas para o método por CLAE. Fontes de variação Entre a) Regressão linear b) Desvio de linearidade Dentro Total * Significativo para p<0,05. gl 6 1 5 14 20 SQ 9,3372 x 1012 9,3370 x 1012 2,6876 x 108 8,0531 x 109 9,3453 x 1012 QM 1,5562 x 1012 9,3370 x 1012 5,3752 x 107 5,7522 x 108 Fcal 2705,40* 16231,94* 0,093 Ftab 4,46 8,86 4,69 Tabela 22. Análise de variância (ANOVA) comparando os resultados obtidos por CLAE e pelos métodos 4 e 5 por VMNA. Fontes de variação Entre Dentro (Erro resíduo) Total * Significativo para p<0,05. gl 2 25 27 SQ 2,8019 12,0629 14,8648 QM 1,4009 0,4825 Fcal 2,9034 Ftab 3,35 129