Estudos de complementação fenotípica do mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae pelos genes uvr de Escherichia coli

Abstract

O mecanismo de reparação de DNA por excisão de nucleotídeos (NER) é o mais universal e conservado sistema de reparação encontrado em organismos procarióticos e eucarióticos. Em bactérias, a via NER é mediada pelos produtos dos genes uvrA, uvrB e uvrC, conhecido como complexo UvrABC. A atuação das proteínas Uvr pode ser dividida em quatro passos básicos: reconhecimento do dano e verificação da lesão; incisão; excisão do fragmento danificado; síntese de reparo e ligação. O mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae foi um dos primeiros mutantes isolados sensíveis especificamente aos tratamentos com agentes indutores de pontes intercadeias (ICLs), tais como 8-MOP+UVA e mustarda nitrogenada (HN2). O exato mecanismo de participação da proteína Pso2p no reparo de ICLs ainda permanece desconhecido e, portanto, a continuidade da sua caracterização é essencial para compreender melhor os mecanismos e produtos gênicos envolvidos na reparação de ICLs em S. cerevisiae. Além disso, alguns estudos recentes com os mutantes de Escherichia coli uvrA, uvrB e uvrC mostraram uma hipersensibilidade do mutante uvrB à 8-MOP + UVA, bem como a incapacidade de reconstituir DNA de alta massa molecular, característica esta semelhante ao fenótipo do mutante pso2-1 de S. cerevisiae. Neste trabalho, é apresentada a subclonagem e a expressão dos genes uvrB e uvrC de E. coli no mutante pso2-1 de Saccharomyces cerevisiae, com o objetivo de testar os fenótipos de sensibilidade e mutagênese deste mutante frente a alguns agentes genotóxicos. Os genes uvrB e uvrC foram amplificados por PCR a partir do DNA genômico de uma linhagem selvagem de E. coli, subclonados no vetor de expressão de levedura pVT103-U, sendo a transformação realizada por meio de choque térmico nas linhagens pso2-1 e selvagem de S. cerevisiae. A análise de complementação fenotípica e mutagênica foi realizada frente aos psoralenos fotoativados (8-MOP+UVA e 3-CPs+UVA) e radiação UVC. A análise da expressão dos genes uvrB e uvrC foi desenvolvida com o emprego da técnica de RT-PCR. Os dados mostram que, apesar da presença dos transcritos uvrB e uvrC no mutante pso2-1 de S. cerevisiae, não houve restauração dos fenótipos de resistência e mutagênese para ICLs, um possível indicativo de ausência de similaridade funcional entre as proteínas UvrB, UvrC e Pso2p.

Nucleotide excision repair (NER) is a universal and highly conserved DNA repair pathway found in prokaryotes and eukaryotes. In bacteria, NER is mediated by uvrA, uvrB and uvrC gene products, composing the UvrABC protein complex. The role of Uvr proteins can be divided in four basic steps: damage recognition, dual incision, repair synthesis and ligation. The mutant pso2-1 was primarily isolated by its specific sensitivity to agents that produce interstrand cross-links (ICLs), like 8-MOP + UVA and nitrogen mustard (HN2). The exact mechanism of how Pso2p participate in the ICL repair is unclear, and its characterization is essential to understand the mechanisms and the gene products related to ICL repair. Some recent studies with uvrA, uvrB and uvrC E. coli strains indicated that the uvrB strain is hypersensitive to 8-MOP + UVA and it is incapable to restore the high molecular weight DNA, like the pso2-1 yeast mutant. In this work we have arried out the subcloning and expression of E. coli uvrB and uvrC genes in the S. cerevisiae pso2-1 mutant with the purpose to test the sensitivity and mutagenesis of transformed yeast strains after treatment with genotoxic agents. The uvrB and uvrC genes were amplified by PCR from an E. coli wild-type (WT) strain, subcloned into the yeast expression vector pVT103-U and transformed in the WT and pso2-1 yeast strains by heat shock. The analysis of phenotypic complementation was performed with photoactivated psoralens (8-MOP+UVA and 3-CPs+UVA) and UVC. The expression analysis of uvrB and uvrC was carried out the RT-PCR technique. The results show that the E. coli uvrB and uvrC genes cannot complement the yeast pso2-1 mutant, despite the presence of uvrB and uvrC transcripts. These results indicate that the proteins UvrB, UvrC and Pso2p probably do not share a functional similarity.