Geração de espécies reativas por fluconazol em Candida glabrata : ativação de enzimas antioxidantes e dano oxidativo no DNA

Abstract

A participação das espécies reativas de oxigênio (ERO) no mecanismo de ação dos antifúngicos azólicos, bem como a relação entre resistência aos antifúngicos e resposta ao estresse oxidativo, têm sido sugeridos. Entretanto, os dados ainda são inconclusivos e diferem entre os micro-organismos. Neste estudo estão apresentados os resultados da geração de ERO pelo fluconazol em isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes a esse antifúngico e a resposta antioxidante da levedura. Nesses isolados, tratados e não tratados com fluconazol em concentração subinibitória, de acordo com sua concentração inibitória mínima (CIM), até fase de crescimento estacionário, foi avaliado se o fluconazol geraria ERO. Subsequentemente, foram analisadas as defesas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx), superóxido dismutase (SOD), glutationa-S-transferase (GST), consumo de peróxido de hidrogênio e glutationa total, bem como possível dano oxidativo causado pelo fluconazol em lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e os níveis de nitritos e nitratos. Os resultados mostram que nos isolados de C. glabrata sensíveis e resistentes ao fluconazol, na presença do antifúngico, houve um aumento da geração ERO e maior atividade enzimática da GPx e SOD comparada a dos isolados não tratados com fluconazol, não havendo diferença estatística entre isolados sensíveis e resistentes nesses três parâmetros citados. Em relação à enzima GST, os isolados sensíveis mostraram maior atividade enzimática comparada aos resistentes, e quando as células sensíveis foram tratadas com fluconazol, a atividade da GST diminuiu. O fluconazol não induziu dano oxidativo em proteínas e em lipídeos, entretanto foi observado dano oxidativo ao DNA. Diante disso, sugere-se que o fluconazol gera ERO como parte do seu mecanismo antifúngico em C. glabrata em fase de crescimento estacionário, induzindo dano oxidativo no DNA. Como resposta, observa-se aumento na atividade enzimática da SOD e da GPx na levedura. O entendimento da resposta antioxidante de leveduras patogênicas tem importante interesse clínico, uma vez que o desenvolvimento racional de novas drogas antifúngicas requer conhecimento do metabolismo fúngico.

The participation of reactive oxygen species (ROS) in azoles antifungal mechanism of action has been suggested, as well as the relation between antifungal resistance and oxidative stress response. However, data are still inconclusive and differ between microorganisms. This study presents the results of ROS generation by fluconazole in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains and their antioxidant response. It was evaluated whether fluconazole generates ROS in those isolates treated and untreated with fluconazole at sub-inhibitory concentration according to their minimal inhibitory concentration (MIC). This treatment was conducted until stationary growth phase was reached. Subsequently, the antioxidant defenses glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), glutathione-S-transferase (GST), consumption of hydrogen peroxide and total glutathione, the possible oxidative damage in lipids, proteins and nucleic acids and the levels of nitrites and nitrates were analyzed. Results showed increased ROS generation in fluconazole-susceptible and resistant C. glabrata strains treated with fluconazole, and also higher GPx and SOD enzymatic activity, compared to untreated cells. No statistical difference of those three parameters was observed between susceptible and resistant strains. In relation to GST, susceptible strains demonstrated higher activity compared to the resistant ones, and when susceptible cells were treated with fluconazole the GST activity decreased compared to untreated. Fluconazole did not induce oxidative damage in proteins and in lipids, however oxidative DNA damage was observed. Therefore, it is suggested that fluconazole generates ROS as part of its antifungal mechanism in C. glabrata at stationary growth phase, inducing oxidative DNA damage. In response, there was increase in the enzymatic activity of SOD and GPx in yeast. The understanding of the pathogenic yeast antioxidant response has important clinical interest, since the rational development of new antifungal drugs requires knowledge about the fungal metabolism.