Caracterização de determinantes de resistência a antimicrobianos em isolados de Salmonella enterica subsp. enterica provenientes da cadeia produtiva de suínos no sul do Brasil

Abstract

Salmonella enterica subsp. enterica (S.) é considerada umas das causas mais comuns de doenças transmitidas por alimentos e a carne suína é responsável por um número significativo de casos de salmonelose humana. Além do risco apresentado por Salmonella como patógeno transmitido por alimentos, existe a preocupação mundial com a emergência de cepas resistentes a múltiplos agentes antimicrobianos. Esta tese compreende três estudos que visam determinar as bases fenotípicas e genotípicas da resistência aos agentes antimicrobianos entre isolados de Salmonella obtidos em diferentes etapas da cadeia produtiva de suínos. Um total de 225 isolados obtidos de fábricas de ração, ambiente, carcaças e conteúdo intestinal de suínos foram submetidos ao teste de suscetibilidade frente a doze agentes antimicrobianos através da técnica de disco difusão. A concentração inibitória mínima (MIC) para a ciprofloxacina foi avaliada através da técnica de diluição em ágar e genes de resistência a antimicrobianos foram investigados através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) [Capítulo 2]. Resistência a, pelo menos, um agente antimicrobiano foi observada em 76 % dos isolados testados e multi-resistência foi encontrada em 40,4 % dos isolados. A resistência ocorreu mais frequentemente à tetraciclina (54,5 %), sulfonamidas (39,6 %) e estreptomicina (33,7 %). A reduzida suscetibilidade à ciprofloxacina foi observada em 94,1 % dos isolados resistentes ao ácido nalidíxico. Foi possível observar que isolados de ambiente, conteúdo intestinal e carcaças apresentaram perfis genotípicos comuns. Vinte e sete isolados multi-resistentes de S. Derby foram investigados quanto a sua relação genética através da técnica de macro-restrição do DNA total, genes de resistência e presença de integrons de classe 1 e 2 através da PCR [Capítulo 3]. Mesmo sendo provenientes de diferentes abatedouros, os isolados foram indistinguíveis em seus perfis fenotípicos e genotípicos de resistência e perfil de macro-restrição. Eles carreavam cassetes gênicos associados a integrons de classe 1 com uma nova variante do gene aadA, denominada aadA26, conferindo resistência à estreptomicina e espectinomicina. Os integrons de classe 1 foram identificados supostamente no cromossomo de S. Derby, uma vez que a hibridização não revelou sinal quando DNA plasmidial foi utilizado como alvo. A análise das sequências que flanqueiam o cassete gênico e a amplificação do gene merA sugerem a localização em elementos transponíveis da família Tn21. Quarenta e cinco isolados multi-resistentes de S. Typhimurium foram analisados quanto a sua relação genética através da técnica de macro-restrição do DNA total. Genes de resistência, integrons e genes plasmidiais mediando resistência adquirida às quinolonas (PMQR) foram investigados por PCR. Os amplicons da região variável dos integrons e da região determinante de resistência às quinolonas (QRDR) foram sequenciados. Os plasmídeos foram caracterizados por lise alcalina, conjugação e identificação dos grupos de incompatibilidade [Capítulo 4]. Isolados multi-resistentes de S. Typhimurium apresentaram variabilidade em sua estrutura genômica e perfis fenotípicos e genotípicos de resistência. Apenas substituições únicas foram observadas em QRDR do gene gyrA e PMQR não foram encontrados. Integron de classe 1 abrigando o cassete gênico aadA ou um integron de classe 1 atípico com o cassete gênico dfrA12-orfF-aadA27 foram caracterizados. Ambos foram localizados em grandes plasmídeos conjugativos. Os genes de virulência plasmidiais de Salmonella spvR, spvA, spvB, rck e pefA foram identificados em um plasmídeo de resistência IncFIB. Os estudos realizados permitem concluir que cepas originárias de animais e carcaças apresentaram maior frequência de resistência quando comparadas com cepas de fábrica de ração, demonstrando que cepas resistentes selecionadas na granja podem chegar ao produto final e suínos podem servir como reservatórios de cepas multi-resistentes de Salmonella para humanos. Nesse sentido, a localização de genes de resistência em elementos genéticos móveis contribui para a manutenção e disseminação da resistência em isolados de Salmonella provenientes da cadeia produtiva de suínos.

Salmonella enterica subsp. enterica (S.) is considered one of the most common causes of food-borne diseases and pork has been associated with a significant number of human cases of salmonellosis. Additionally to the risk presented by Salmonella as a food-borne pathogen, there is a global concern about the emergence of antimicrobial multi-resistant isolates. This thesis comprises three studies that aimed to determine the phenotypic and genotypic basis of antimicrobial resistance among Salmonella isolates from different steps of the swine production system. A total of 225 Salmonella isolates from feed mills, lairage environment, carcasses and intestinal content of the pigs were tested for antimicrobial susceptibility against twelve different antimicrobial agents by agar disc diffusion. The minimum inhibitory concentration (MIC) for ciprofloxacin was screened by agar dilution and antimicrobial resistance genes were investigated by Polymerase Chain Reaction (PCR) assays [Chapter 2]. Among tested isolates, 76 % showed resistance to at least one antimicrobial agent and 40.4 % were multi-resistant. Resistance occurred most frequently to tetracycline (54.5 %), sulphonamides (39.6 %) and streptomycin (33.7 %). Thirty-two (94.1 %) nalidixic acid-resistant isolates exhibited decreased susceptibility to ciprofloxacin. It was observed that strains from lairage, carcasses and intestinal contents displayed common resistance gene profiles. Twenty-seven multi-resistant S. Derby were investigated for their molecular relationships by macrorestriction analysis, genotypic resistance and presence of the class 1 and 2 integrons by PCR assays [Chapter 3]. The isolates from different slaughterhouses displayed the same phenotypic and genotypic resistance, as well as indistinguishable macrorestriction pattern. They carried class 1 integron-associated gene cassette with a new aadA variant, designated aadA26, encoding for streptomycin and spectinomycin resistance. Since the hybridization experiments did not yield signals when using plasmid DNA as targets, the class 1 integrons are supposed to be located in the chromosomal DNA of S. Derby. The sequence of the flanking regions of this gene cassette and the amplification of the merA gene may indicate the location of the class 1 integron into a Tn21-related transposon. Forty-five multi-resistant S. Typhimurium isolates were analysed for their molecular relationships by macrorestriction analysis. Resistance genes, integrons and plasmid-mediated quinolone resistance genes (PMQR) were identified by PCR. Amplicons for the variable part of class 1 integrons and from the quinolone resistance-determining regions (QRDR) were sequenced. Plasmids were characterized by alkaline lysis, conjugation and replicon typing [Chapter 4]. Multiresistant S. Typhimurium isolates showed high variability in their genomic structure and resistance properties. Only single substitutions were found in the QRDR of gyrA and no PMQR were found. Class 1 integron with aadA23 gene cassette or an unusual integron carrying dfrA12-orfF-aadA27 gene cassette were characterized. Both located on large and conjugative plasmids. Salmonella plasmid-located virulence genes spvR, spvA, spvB, rck and pefA were found on a multi-resistance IncFIB plasmid. The studies conducted demonstrate that strains from pigs and carcasses displayed higher resistance frequency to most antimicrobial tested compared with isolates from feed mills, demonstrating that resistance genes selected on farm can be found in pork and pigs may serve as reservoirs of multi-resistant Salmonella strains. In this sense, the location of resistance genes on mobile genetic elements contributes to the maintenance and spread of antimicrobial resistance among Salmonella isolates from swine production systems.