Avaliação da eficiência de co-transformação de soja (Glycine max (L.) Merrill) via bombardeamento de partículas utilizando um gene de seleção e um gene de interesse em plamídeos diferentes

Abstract

Visando aumentar a resistência a moléstias fúngicas, o presente trabalho teve como objetivo introduzir um gene (chit1) que codifica uma quitinase do fungo Metarhizium anisopliae em cultivares de soja [Glycine max (L.) Merrill]. A co-transformação foi a estratégia escolhida, visando a obtenção de plantas livres de transgenes marcadores na progênie das plantas transformadas. A co-transformação foi realizada via biolística, tendo como tecido-alvo conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5. O plasmídeo pGusHyg, que contém o gene repórter gusA e o gene marcador hpt, foi bombardeado concomitantemente com o plasmídeo pMOG463chit1, que porta o gene chit1. Os conjuntos de embriões bombardeados foram transferidos para meio seletivo contendo higromicina, visando a obtenção de material estavelmente transformado. Os conjuntos embriogênicos higromicina-resistentes foram transferidos seqüencialmente para meios de proliferação D-20 (sem higromicina), maturação e regeneração. No total, foram obtidos 387 e 380 embriões histodiferenciados das cultivares MG/BR46 Conquista e IAS-5, respectivamente. Plantas transgênicas adultas e férteis foram regeneradas. Para avaliar a eficiência da estratégia de cotransformação, foram realizadas análises moleculares de embriões histodiferenciados e de plantas regeneradas. Os resultados obtidos neste trabalho permitiram o cálculo da taxa de co-transformação de 44% para os embriões histodiferenciados da cultivar MG/BR46 Conquista e de 50% para plantas de IAS-5. Não existem, até o momento, relatos de trabalhos em soja utilizando embriões somáticos globulares em proliferação como alvo para estudos de co-transformação.

Aiming the increase of plant resistance to fungal disease, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (chit1) coding a chitinase from Metarhizium anisopliae in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merril]. Co-transformation was the strategy elected, in order to obtain marker-free transgenic plants in the progeny of transformed plants. Co-transformation was performed via biolistic using somatic globular embryo clusters of MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars as target tissues. Plasmid pGusHyg, containg the reporter gusA gene and the selectable marker hpt gene, was co-delivered with the pMOG463chit1 plasmid containg the chit1 gene. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 387 and 380 histodifferentiated embryos were respectively obtained from MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars. Transgenic adult fertile plants were regenerated. To evaluate the co-transformation eficiency, DNA from histodifferentiated embryos and from regenerated fertile plants was submitted to molecular analysis. Data obtained allowed us to calculate co-transformation frequencies of 44% and 50% for MG/BR46 Conquista and IAS-5 cultivars, respectively. As far as we are concerned there is no studies utilizing soybean somatic embryos for cotransformation via biolistic.