Identificação, caracterização e análise filogenética de pestivírus em bovinos

Abstract

Atualmente, o Brasil é o segundo maior exportador de carne bovina e o sexto exportador de leite no mundo. Visando melhorar a produtividade da bovinocultura, torna-se importante a aplicação de programas sanitários adequados e eficientes. As doenças virais são preocupações constantes em qualquer programa de sanidade, devido aos grandes prejuízos econômicos que causam e o seu diagnóstico correto depende de técnicas laboratoriais eficientes. O gênero Pestivirus, da família Flaviviridae, possui três espécies reconhecidas que podem infectar bovinos: o vírus da diarreia viral bovina tipo 1 (BVDV-1), o BVDV-2 e o vírus da doença da fronteira (BDV), além de uma espécie atípica proposta como BVDV-3. Causam principalmente distúrbios respiratórios, reprodutivos e digestivos em bovinos, levando a queda de índices de produção. Os objetivos do presente trabalho foram: descrever o uso de uma técnica modificada de detecção de agentes virais que possam estar presentes em insumos utilizados na reprodução assistida e descrever a caracterização patológica e análise filogenética de pestivírus detectados em um surto da doença, sendo os dados apresentados sob a forma de dois artigos. No primeiro, pools de líquidos foliculares colhidos durante a punção ovariana de vacas para coleta de oócitos para produção in vitro de embriões foram selecionados. As amostras foram analisadas para a detecção de BVDV, herpesvirus bovino tipo 1 (BoHV-1) e 5 (BoHV-5) por isolamento viral, RT-PCR e nested PCR, sendo utilizados dois protocolos de extração de DNA e RNA: um convencional e o outro com adição de etapas pré-extração de ácido nucleico, no intuito de reduzir possíveis inibidores de RT-PCR e PCR presentes nas amostras. A utilização da técnica de pré-extração permitiu detectar um maior número de amostras positivas. No segundo trabalho, foi descrito um surto de diarreia viral bovina em um rebanho que foi testado por imunohistoquímica, ELISA, isolamento viral, RT-PCR e sequenciamento de três regiões do genoma. Foram obtidas quatro amostras distintas de BVDV-3 e as principais alterações clinicas foram encontradas nos sistemas digestivo e respiratório, mas lesões de pele e opacidade de córnea também foram observadas. Os resultados encontrados nos trabalhos realizados reforçam a necessidade da verificação quanto à presença de patógenos em materiais biológicos utilizados na reprodução assistida utilizando técnicas sensíveis e que a doença causada por BVDV-3 em bovinos é indistinguível clinicamente das causadas por outros pestivírus, sugerindo que pestivírus atípicos podem estar subdiagnosticados nos rebanhos brasileiros.

Currently, Brazil is the second largest beef and the sixth milk exporter worldwide. To improve the livestock productivity, it becomes important the applying of appropriate and efficient health programs. Viral diseases are constant concerns on any health program due to major economic losses they cause and their correct diagnosis depends of the development of efficient diagnostic techniques. The genus Pestivirus of the family Flaviviridae, has three recognized species which can infect cattle: the bovine viral diarrhea virus type 1 (BVDV-1), BVDV-2 and border disease virus (BDV), and one atypical species putatively named as BVDV-3. These viruses mainly cause respiratory, digestive and reproductive disturbances in cattle, resulting in decrease of production rates. The goals of the present work were: describe the use of a modified procedure in detecting viral agents that may be present on byproducts utilized in assisted reproduction and describe the pathological and phylogenetic frame of pestivirus detected in an outbreak of disease. The data was presented in two papers. In the first study, pooled follicular fluid collected during oocyte retrieval for in vitro embryo production were selected. The samples were analyzed for BVDV, bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) and 5 (BoHV-5) by virus isolation, RT-PCR and nested PCR, using two extraction protocols for DNA and RNA: a conventional and the other with addition of pre-extraction of nucleic acid step, in order to reduce potential inhibitors of PCR and RT-PCR present in the samples. The use of the prenucleic acid procedure allowed detecting a greater number of positive samples. In the second paper, an outbreak of bovine viral diarrhea virus was described and has been tested by immunohistochemistry, ELISA, virus isolation, RT-PCR and sequencing of three regions of the genome. Four different BVDV-3 samples were obtained and major clinical disturbances were found in the digestive and respiratory systems, but skin lesions and corneal opacity were also observed. The results obtained in the works underscore the need in checking for pathogens in biologicals used in assisted reproduction utilizing sensitive techniques and shows that the disease caused by BVDV-3 in cattle is clinically undistinguishable from those caused by other pestiviruses, suggesting that atypical pestivirus may be underdiagnosed in the Brazilian herds.