Detecção e diferenciação de Anaplasma marginalee Anaplasma centralepor reação em cadeia de polimerase (PCR)

Abstract

O patógeno intracelular Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae) é endêmico em muitas regiões tropicais e subtropicais do mundo. A infecção do bovino com A. marginale causa anaplasmose bovina, devido à replicação do microrganismo nos eritrócitos do hospedeiro, sendo responsável por consideráveis perdas econômicas à criação de gado. A transmissão de A. marginale para bovinos ocorre biologicamente por carrapatos ou mecanicamente por insetos hematófagos e instrumentos contaminados com sangue infectado. Uma cepa de A. centrale, naturalmente atenuada tem sido usada extensivamente para controle da anaplasmose bovina em diversas regiões do mundo. A vacina de A. centrale é produzida em bovinos esplenectomizados oriundos de áreas livres de carrapato, todavia uma contaminação acidental por A. marginale é um risco durante o processo de produção. Por este motivo, a produção da vacina deve ser avaliada, para garantir uma amostra de A. centrale livre de contaminação. Durante a fase aguda da doença, o diagnóstico é realizado pela observação de A. marginale por esfregaço sanguíneo, porém durante a fase crônica, este método não tem a sensibilidade necessária para detectar animais que portam níveis baixos de parasitemia. Sendo, o método de detecção molecular o mais indicado para detectar tanto anaplasmose aguda quanto crônica e diferenciar entre A. marginale e A. centrale. Deste modo, no presente trabalho um ensaio de PCR foi padronizado para detectar e diferenciar A. marginale de A. centrale em amostras de sangue bovino. Foram utilizados primers para o gene msp4 de Anaplasma sp. para a amplificação do material obtido a partir de uma extração de DNA de sangue congelado de bovinos experimentalmente infectados com A. centrale e A. marginale. A PCR se mostrou específica, sem amplificar o DNA de outros hemoparasitas. O teste se mostrou sensível para detectar a quantidade 0,25 pg para o DNA de A. centrale e 0,125 pg para detectar o DNA de A. marginale, mostrando-se útil para detectar animais à campo persistentemente infectados com A. marginale e vacinados com A. centrale, os quais foram indetectáveis pela microscopia óptica. Em resumo, a PCR é um teste mais sensível e específico que a microscopia óptica para detectar e diferenciar as espécies de A. centrale e A. marginale, mostrando-se útil para auxiliar no controle de qualidade durante a produção da vacina.

The intracellular pathogen Anaplasma marginale (Rickttsiales: Anaplasmataceae), is endemic in many tropical and subtropical regions of the world. Infection of cattle with A. marginale causes bovine anaplasmosis, due to replication of the microrganism inside the erythrocytes being responsible for considerable economic losses to livestock. The transmission of A. marginale to cattle occurs biologically by ticks or mechanically by blood sucking insects and instruments contaminated with infected blood. A strain of A. centrale, naturally attenuated, has been used extensively to control bovine anaplasmosis in various regions of the world. The vaccine with A. centrale is produced in splenectomized cattle from tick-free areas, however accidental contamination by A. marginale represents a risk during the production process. Therefore, production of the vaccine should be evaluated to ensure a sample of A. centrale free of contamination. During the acute phase of the disease, diagnosis is made by observing A. marginale by blood smear, but during the chronic phase, this method is not as sensitivity as required to detect animals that carry low levels of parasitemia. Being, the molecular detection method more appropriate for detecting both acute and chronic anaplasmosis and differentiate between A. centrale and A. marginale. Thus, in this study a PCR assay was standardized to detect and differentiate A. centrale and A. marginale in samples of bovine blood. Primers for msp4 gene of Anaplasma sp. were used for amplification of material obtained from a DNA extraction of frozen blood from bovines experimentally infected with A. centrale and A. marginale. The PCR showed to be specific, do not amplifying the DNA of other hemoparasites. The test was sensitive to detect the amount of 0.25 pg of DNA from A. centrale and 0.125 pg of DNA from A. marginale, proving to be useful for detecting field animals persistently infected with A. marginale and vaccinated with A. centrale, which were undetectable by optical microscopy. Briefly, PCR is a more sensitive and specific test than the optical microscopy analysis to detect and differentiate the species A. centrale and A. marginale showing to be useful to assist the quality control during the vaccine production.