Nuclear characterization of tumor stem cells in human glioblastoma

Abstract

Gliomas são tumores do sistema nervoso central caracterizados como sendo extremamente agressivos, altamente invasivos, assim como neurologicamente destrutivos. Eles apresentam características que ajudam a garantir a sua formação e desenvolvimento, tais como: evasão da apoptose, replicação ilimitada, capacidade de proliferar sem estímulos externos, capacidade de crescer apesar dos mecanismos externos de supressão e uma alta resistência a quimio e radioterapia. Evidências recentes sugerem que gliomas são tumores heterogêneos composto por células diferenciadas e células indiferenciadas conhecidas como células tronco tumorais (CSCs), que estariam diretamente envolvidas na alta resistência aos tratamentos. O objetivo deste estudo foi caracterizar os núcleos de CSCs transfectadas com ZsGreen para verificar a presença de mitose e irregularidades nuclear característica de apoptose, catástrofe mitótica e senescência em tanto as CSCs quanto as suas células vizinhas, com ou sem a presença de fatores de crescimento. O plasmídeo do ZsGreen é uma proteína fluorescente acoplada com uma sequência degradada pelo proteassoma (ornitina decarboxilase) que pode ser visto através de microscopia de fluorescência em células com atividade proteassomal baixo. Células de glioma U87 foram cultivadas em condições normais utilizando o meio com 5% SFB ou com fatores de crescimento (meio específico para CSC). Quatro poços de uma placa de 24 poços foram semeados com 50.000 células, enquanto dois poços foram tranfectados com ZsGreen, os outros dois foram usados como grupo controle sem tranfecção. Um poço de controle e um poço transfectado tinham meio DMEM Low glucose com SFB enquanto os outros dois poços continham meio DMEM F12 suplementado com FGF, EGF, LIF e B27. A coloração nuclear com Hoechst também foi utilizada com estas células U87, a fim de exibí-los através de microscopia fluorescente e analisar seu tamanho e forma usando o plugin NMA do programa ImageJ. Embora a transfecção e coloração nuclear foram realizados com sucesso, vários fatores causaram dificuldades em analisar as fotos e compilação dos resultados. Estes fatores incluem: indefinição da resolução das fotos, a interferência de restos celulares, a população experimental insuficiente, entre outros. A fim de realizar estudos adicionais na pesquisa de CSCs, mudanças devem ser feitas para melhorar a eficiência e praticidade deste projeto, como se concentrar em uma irregularidade específica (como senescência) e tentando induzir essa irregularidade através de métodos de tratamento específico in vitro.

Gliomas are tumors of the central nervous system that possess glial characteristics and have been distinguished as being extremely aggressive, highly invasive, as well as neurologically destructive. Gliomas possess certain characteristics that help ensure their successful formation and development, such as: evasion of apoptosis, unlimited replication, the capacity to proliferate without external stimuli, the ability to grow despite external suppressive mechanisms, and a high resistance to both chemo and radiotherapy. Recent evidence suggests that gliomas are heterogeneous tumors comprised of both differentiated cells and a type of undifferentiated cells known as cancer stem cells (CSCs), which are thought to be directly involved in the high resistance to treatments and therapies. The specific objective of this study was to characterize the nuclei of CSCs transfected with a marker called ZsGreen to verify the presence of mitosis and nuclear irregularities characteristic of apoptosis, mitotic catastrophe, and senescence in either the CSCs or their neighboring cells with or without the presence of growth factors. ZsGreen is a green fluorescent protein that can be selectively viewed under fluorescence microscopy in cells with low proteasome activity due to the proteasomal recognition of the ornithine decarboxylase (ODC) degradation sequence. U87 glioma cells were cultured under standard conditions using both medium with 5% FBS and with growth factors (CSC culture medium). Four wells of a 24-well plate were each seeded with 50,000 cells, while two wells were transfected with ZsGreen and the other two were used as control groups without transfection. One control well and one transfected had medium with FBS while the other two wells were supplemented with basic Fibroblast Growth Factor (FGF), Epidermal Growth Factor (EGF), Leukemia Inhibitory Factor (LIF), as well as B27 supplement. Hoechst was also utilized with these U87 cells in order to view them under fluorescent microscopy and analyze their nucleus size and form using the NMA plugin of the ImageJ program. Although the transfection and nuclear staining were successfully performed, various factors provided difficulties in analyzing these photos and compiling the results. These factors included: unclear photo resolution, interference from cell debris, insufficient experimental population, among others. In order to conduct further studies concerning CSC research, major changes should be made to enhance the efficiency and practicality of this project, such as focusing on a specific irregularity (senescence, for example) and trying to induce that irregularity through specific in vitro treatment methods. More reliable methods of data analysis could also be utilized regarding the general topic of CSC research such as flow cytometry or Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).